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weleozhu银虫 (小有名气)
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[求助]
使用Sau3AI建立水稻shotgun库，但连接多次不长，求经验大神帮助已有1人参与
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| 我最近在构建一个水稻的shotgun亚克隆文库，质粒来源是水稻的BAC文库的一个BAC质粒，使用的是PUC19作为载体，回收的片段为7-10K，酶切质粒条件摸索得差不多了，在目的区域也有比较集中的片段，然后切胶回收后，连接到用BamHI酶切然后用NEB CIP脱磷的PUC19上，问题就出在这，连接转化后就是不见一个菌斑。 我转化的菌株是XL1-Blue，用的是电转化， 感受态效率已经经过验证，没有问题，符合建库要求。最近被这个快烦死了，都快两个月了，求求大神棒棒忙，或者改一下方案也行。问题解决了加送金币。 |
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2楼2016-01-18 17:23:56
【答案】应助回帖
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weleozhu: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 后面的童鞋可以试试 2016-02-25 17:30:36
weleozhu: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 后面的童鞋可以试试 2016-02-25 17:30:36
| 今天又看到了该帖，再次说一下我的观点。我建议你换一管新的BamHI 没切载体试一下，然后做一个NEB CIP脱磷前PUC19载体的自连实验，转化后看载体的自连率有多高。上述实验失败，有可能是载体完全没有切开，片段没法连接进去，用CIP脱磷处理后，也不存在载体自连接的情况，故转化后一个菌落都没有。以前我们实验室也碰到过这样的情况。载体酶切时适当的延长酶切的时间，连接时置入4℃冰箱，延长连接的时间。 |
3楼2016-02-25 08:43:25
weleozhu
银虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 457.2
- 帖子: 92
- 在线: 35.3小时
- 虫号: 1978180
- 注册: 2012-09-05
- 专业: 作物种质资源与遗传育种学
4楼2016-02-25 17:29:49