新人第一帖，关于原核表达蛋白后，纯化策略问题。希望大神帮助！谢谢！ - 分子生物 - 生物化学

11楼2015-04-27 15:24:14

virologik

12楼2015-04-27 15:25:17

8wangle

13楼2015-04-27 15:46:55

yejunhong

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7楼: Originally posted by 水天之边 at 2015-04-25 23:18:09
20或者30 mM咪唑狂wash，差不多10-20个柱体积，洗到没有蛋白流出，检测的方法有 1:Bradford检测不显色；2:nanodrop测没浓度；3:紫外测没吸收。然后再用100或者200的咪唑洗脱蛋白。但是如果你的条带下面的带是你蛋白 ...

会不会是二硫键折叠错误导致的条带不单一呢？
今天重新过柱了。跑着胶。今天就洗了20个柱体积。希望有效果。

14楼2015-04-27 22:18:19

yejunhong

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9楼: Originally posted by 3q2002 at 2015-04-26 10:29:49
这种结果已经很好
一个Ni柱子不可能解决所有问题。
珍惜时间，做下一步实验。

那我接下来就过分子筛或者离子交换。希望能有好结果。

15楼2015-04-27 22:20:19

yejunhong

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10楼: Originally posted by jytanji at 2015-04-27 15:14:46
后边加上离子柱和分子筛，妥妥的搞定。

大小相近的蛋白，分子筛是不是不好分开啊？

16楼2015-04-27 22:22:49

jytanji

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16楼: Originally posted by yejunhong at 2015-04-27 22:22:49
大小相近的蛋白，分子筛是不是不好分开啊？...

所以先过离子柱啊。

17楼2015-04-28 09:55:39

3q2002

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15楼: Originally posted by yejunhong at 2015-04-27 22:20:19
那我接下来就过分子筛或者离子交换。希望能有好结果。...

不建议做分子筛。效率太低。而且分子筛保存麻烦。
可以考虑离子交换。但是一般先离子交换后再上Ni柱子。否则，脱盐麻烦。顺序要颠倒一下。

18楼2015-04-28 10:57:03

yejunhong

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17楼: Originally posted by jytanji at 2015-04-28 09:55:39
所以先过离子柱啊。...

我的蛋白10kd，pET32a标签蛋白有20kd，所以条带出现在30kd，我可不可以这样做：
30kd的蛋白过分子筛，去掉了10kd的杂蛋白，然后我切标签，我的蛋白就在10kd，反向又去掉了30kd的杂蛋白。
或者这样。因为杂蛋白应该是有类似组氨酸结构，我切去标签以后，我的蛋白就没有组氨酸标签了，我再过一次ni柱，杂蛋白反倒都挂上去了，我的蛋白在流穿里出来。

19楼2015-04-28 11:48:08

yejunhong

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18楼: Originally posted by 3q2002 at 2015-04-28 10:57:03
不建议做分子筛。效率太低。而且分子筛保存麻烦。
可以考虑离子交换。但是一般先离子交换后再上Ni柱子。否则，脱盐麻烦。顺序要颠倒一下。...

分子筛我们实验室倒是有现成的。我就是怕分子筛分辨率不太好。
我考虑用我回复楼上的那些方法，能不能帮我看看可行不？

20楼2015-04-28 11:49:37