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yejunhong

铜虫 (初入文坛)

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[交流] 新人第一帖，关于原核表达蛋白后，纯化策略问题。希望大神帮助！谢谢！

最近好不容易表达出蛋白，进入纯化。载体用的pET-32a，有his标签，前几天第一次摇了500ml，尝试挂了ni柱。洗脱下来后跑了电泳。结果如下：

$\"新人第一帖，关于原核表达蛋白后，纯化策略问题。希望大神帮助！谢谢！-1\"$
蛋白泳道从左到右依次是：1.M 2.破碎后蛋白上清原液 3.流穿 4.洗脱 5-10分别是20,50,100,200,500mM以及1M咪唑洗脱
maker 从上到下分别是116,66,45,35,25,18,14.
可以看到在50和100mM咪唑浓度时，我的蛋白有被大量洗脱下来。
但是现在问题来了，染色之后虽然我的蛋白条带比较明显，但是杂蛋白感觉也不少。洗脱和20mM浓度时都没有冲下来很多杂蛋白。
最近收了大量的蛋白。过柱子的话，我是不是应该用20mM咪唑多洗几个柱体积？或者在50mM多洗，希望100mM时就能得到较纯的蛋白？
我也想过用分子筛，但是50,100mM泳道的杂蛋白和表达蛋白好像分子量差别不大，分子筛是不是不容易分开呢？
又或者用离子交换或者其他？希望各位能够帮我分析一下。谢谢各位！

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1楼2015-04-23 10:46:53

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yejunhong

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引用回帖:

7楼: Originally posted by 水天之边 at 2015-04-25 23:18:09
20或者30 mM咪唑狂wash，差不多10-20个柱体积，洗到没有蛋白流出，检测的方法有 1:Bradford检测不显色；2:nanodrop测没浓度；3:紫外测没吸收。然后再用100或者200的咪唑洗脱蛋白。但是如果你的条带下面的带是你蛋白 ...

会不会是二硫键折叠错误导致的条带不单一呢？
今天重新过柱了。跑着胶。今天就洗了20个柱体积。希望有效果。