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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 新人第一帖，关于原核表达蛋白后，纯化策略问题。希望大神帮助！谢谢！
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jytanji

金虫 (小有名气)
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yejunhong: 金币+2 2015-04-28 22:10:35
引用回帖:
19楼: Originally posted by yejunhong at 2015-04-28 11:48:08
我的蛋白10kd，pET32a标签蛋白有20kd，所以条带出现在30kd，我可不可以这样做：
30kd的蛋白过分子筛，去掉了10kd的杂蛋白，然后我切标签，我的蛋白就在10kd，反向又去掉了30kd的杂蛋白。
或者这样。因为杂蛋白应 ...

有His标签的蛋白纯化方法，一般为：先挂ni柱富集，用咪唑洗脱后，置换buffer去掉咪唑，酶切去除标签，再挂ni柱蛋白流穿，标签挂柱，取流穿液，如果纯度可以直接分子筛可以根据出峰位置可以查看蛋白的聚合情况收纯的就行，如果纯度不够再加一步离子柱线性洗脱选纯的过分子筛（分子筛分离效果一般般，我主要用来看蛋白是否二聚或是单体）。
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21楼2015-04-28 15:44:53
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yejunhong

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by jytanji at 2015-04-28 15:44:53
有His标签的蛋白纯化方法，一般为：先挂ni柱富集，用咪唑洗脱后，置换buffer去掉咪唑，酶切去除标签，再挂ni柱蛋白流穿，标签挂柱，取流穿液，如果纯度可以直接分子筛可以根据出峰位置可以查看蛋白的聚合情况收纯的 ...

我感觉也是，可以切标签然后收流穿，虽然没切标签以前可能有杂蛋白，在同浓度被洗脱下来，但是只要我再过一次ni柱，杂蛋白依然挂上，我的蛋白就直接流穿了，不知道我的理解对吗？
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22楼2015-04-28 22:10:32
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lijdoc
23楼2015-04-28 22:41:37
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jytanji

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
22楼: Originally posted by yejunhong at 2015-04-28 22:10:32
我感觉也是，可以切标签然后收流穿，虽然没切标签以前可能有杂蛋白，在同浓度被洗脱下来，但是只要我再过一次ni柱，杂蛋白依然挂上，我的蛋白就直接流穿了，不知道我的理解对吗？...

可以这么理解，理论对，实际的话可能还会有部分杂蛋白也会流穿的，所以看胶决定下一步。
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24楼2015-04-30 09:39:38
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水天之边

金虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by yejunhong at 2015-04-27 22:18:19
会不会是二硫键折叠错误导致的条带不单一呢？
今天重新过柱了。跑着胶。今天就洗了20个柱体积。希望有效果。...

一般跑胶的时候在SDS loading buffer里面都加了DTT或者BME的，蛋白变性且二硫键都打开了，所以一般不会是二硫键的问题。
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25楼2015-05-02 00:05:02
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楼楼分生

新虫 (初入文坛)
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你上一下Q柱，做两步纯化试试
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26楼2015-10-16 16:13:24
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