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长风892

木虫 (著名写手)

[交流] 向高手请教——琼脂糖DNA电泳结果分析

我最近跑了琼脂糖DNA电泳,结果不甚理想,但又分析不出是什么原因,请

教了很多人,还是不明白什么原因。请哪位高手指点下,万分感谢!!!

    实验结果请见附件照片,从左到右依次为MARK,阴性组,低剂量组和两个

高剂量组。MARK颜色较浅,阴性组和低剂量组拖尾较严重,两个高剂量组则无

明显拖尾现象(注:药物对肿瘤细胞具有较强的抑制作用)。
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

有可能是样品浓度问题,也就是上样的量。再者提的质量好像不太好。胶的浓度是多少,有没有配错?电流是多少?可能太高了。还有就是缓冲液,是不是该换了。你用什么染色的?EB or goldview?时间是多少,如果是直接加在胶里,调整下浓度。你分析下,换着试试。
活着就要让人感受到你的存在。
2楼2008-07-08 09:44:49
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

是加药之后直接提total DNA然后跑胶吗?
3楼2008-07-08 10:24:24
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长风892

木虫 (著名写手)

用的是试剂盒提的,胶浓度为1.5%,电压60V,电流18MA,电泳2.5H结束,EB染色10分钟,上样量为15UL,请问这与电流大小有关吗?一般常用电流是多少?为什么高剂量没出现拖尾呢?
4楼2008-07-08 10:26:14
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

这样子的,total DNA一般推荐0.3%的胶,但我一般用0.8%的胶,图更加漂亮,更浓的胶就很难跑。如果电泳时间过长,胶发热了,DNA很容易降解。就会有很严重的拖尾。
电压用100V~120V,当二甲苯青跑到1/3左右就可以停(短的小胶)
上样一般取5ul,不过看你的DNA的含量。你上了15ul还是这么淡,很奇怪,浓度太低了吧。

我用过Invitrogen和QIAGEN的盒子来提,效果都不错
5楼2008-07-08 10:31:30
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长风892

木虫 (著名写手)

但是请问前后高低剂量间为什么会有这么大的差异呢?阴性组和低剂量组拖尾较严重,两个高剂量组则无明显拖尾现象
6楼2008-07-08 10:37:25
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

其实不知道你有没有重复过实验就是一定为阴性及低剂量拖尾,高剂量没事
这一点确实比较参不透
难道是试剂盒不好?你用的是什么公司的呢?
或者真的是因为电泳时间太长导致降解拖尾吧~
如果你的药浓度确实挺高的话,那么收细胞之前还是得用PBS洗干净,否则怕那些药对DNA提取过程有影响
我也做加药然后提DNA的,也是同样能够抑制肿瘤生长,很明显提出来的DNA量就少很多了,少1/4左右是很正常的事情,所以电泳跑出来条带的浓度也会不一样
当然像我提很高浓度的,就基本看不出有什么差别了,电泳的分辨率所限
7楼2008-07-08 10:45:03
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长风892

木虫 (著名写手)

重复实验3次,结果一样
国产的TIANGEN试剂盒,收细胞前用生理盐水洗涤3次。请问您的胶通常是多大规格的,电泳时间一般是多长?
8楼2008-07-08 10:53:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

提DNA的话,Tiangen应该不至于那么烂
是不是你提取的时候吹打还有晃动太严重了?
提DNA的时候千万别吹打试剂混匀,我都是悬空滴加试剂
混匀是颠转混匀的,或者用手指轻弹管壁
如果DNA被切断了,确实很容易拖尾

我的胶是25ml的那种小胶(绝对够的),0.8%
电泳时间的话,100V估计跑个40~45min都可以了
缓冲液是0.5X的TBE
9楼2008-07-08 11:00:49
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长风892

木虫 (著名写手)

噢,谢谢!!!两个高剂量组则无明显拖尾现象的可能原因是什么呢?帮忙分析下,有没有可能是浓度太低了而不明显啊
10楼2008-07-08 11:11:35
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