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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 难道这个问题真的没有人遇到过吗？
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

[求助] 难道这个问题真的没有人遇到过吗？已有1人参与

最近在做毕赤酵母表达，pGAPZ ALHPA A这个载体，菌株是SMD1168H。筛选以后提了酵母基因组，PCR也扩到了条带，但是问题出现了，这些菌落在平板上是有酶活的，试了三种底物，都证明在平板上有酶活。但是液体发酵，试了YPDS,YEPG,YNB BMGW培养基，碳源用了Lactose,glucose,sorbitol,从第一天开始摇瓶，测了21天没测到酶活，不存在没有分泌的可能，因为胞外胞内全测了。折腾了快半年了，老板说他从来没遇到过这种情况，我就想知道，难道真的没有人遇到过么？
对了，还浓缩了上清，做了SDS-PAGA 和HIS-TAG INVISION STAIN，全都弥散，没有条带。如果真没压根就没产蛋白，那平板上三种不同底物的酶活是哪里来的？
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1楼2015-04-09 14:09:34
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lomis at 2015-04-10 08:50:35
1. 你确定平板上没有干扰因素干扰显色？
2. 在平板上即使有酶活，不说明是分泌的，因为如果你的底物是小分子，在胞内表达的也可以显色，平板显色本身来说是一个很灵敏的筛选方法，一点点的酶就可以（大部分单个菌落 ...

1、平板上应该没有干扰因素显色，并且我把平板上的菌落刮起来用缓冲液洗涤，用上清与天然底物反应，做HPLC，空白无产物，但是插入我的基因的菌落有产物。
2、SMD1168H这个菌株含有蛋白酶抑制剂，本身就是防止酶讲解的。
3、已经在大肠中表达过，想换到其他体系表达，就选了酵母。

高手快提点意见
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5楼2015-04-10 09:31:56
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chrome1986

木虫 (正式写手)
说不定是重大发现。
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走自已的路，让别人跟着你走！
2楼2015-04-10 08:30:00
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lomis

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-04-10 09:21:59
1. 你确定平板上没有干扰因素干扰显色？
2. 在平板上即使有酶活，不说明是分泌的，因为如果你的底物是小分子，在胞内表达的也可以显色，平板显色本身来说是一个很灵敏的筛选方法，一点点的酶就可以（大部分单个菌落的表达量足以显色），即使是瞬时表达的，也可以显色。而你在发酵液中表达后可能测试的时候已降解。
3. 如果是我，因为时间是有限的，我会更换载体或宿主，如果还是一样情况，则不用酵母表达，更换其他宿主。
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没有命运，只有选择！
3楼2015-04-10 08:50:35
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chrome1986 at 2015-04-10 08:30:00
说不定是重大发现。

回家做饭去，我还以为有人给我解答了呢。
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4楼2015-04-10 09:27:25
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