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tongqingjia

铜虫 (小有名气)

[求助] 蛋白质纯化 已有3人参与

研究的是带有GST标签的融合蛋白，柱上切收集的蛋白浓缩后（1ml左右），跑胶出现多条杂蛋白带，是不是蛋白液浓缩体积很少时，很多非目的蛋白的条带都会出现？急需指导，麻烦虫子们给予帮助吧，谢谢谢谢！
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1楼 2015-04-01 09:22:10
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wanglele87

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-04-02 23:35:04
引用回帖:
3楼: Originally posted by tongqingjia at 2015-04-01 10:21:36
柱材料是4FF,而且过夜结合，柱上切之后，将收集的蛋白重新反挂柱除去GST，是不是利用亲和柱纯化效果不如分子筛 之类的？...

GST特异性比较好，一般过完是会比较纯的，可能会有一些单独的tag。不过我一般不会柱上切，回elute下来再切。分子筛一般纯化效果不好，除非蛋白分子量差别比较大，用来换buffer，一般作为最后一步纯化。楼主先换掉gsh，反挂下gst柱试试，不行的话试试离子柱。有的时候可能是蛋白折叠的问题，常常会粘一些杂蛋白，不好分开。

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一生不羁放纵爱自由
4楼2015-04-01 11:04:54
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普通回帖

wanglele87

金虫 (著名写手)
这个问题我竟不知如何回答。不纯只能说过得亲和竹效果不好，再试试离子柱分子筛的看看吧

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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

tongqingjia
一生不羁放纵爱自由
2楼2015-04-01 09:41:31
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tongqingjia

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wanglele87 at 2015-04-01 09:41:31
这个问题我竟不知如何回答。不纯只能说过得亲和竹效果不好，再试试离子柱分子筛的看看吧

柱材料是4FF,而且过夜结合，柱上切之后，将收集的蛋白重新反挂柱除去GST，是不是利用亲和柱纯化效果不如分子筛 之类的？
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3楼2015-04-01 10:21:36
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tongqingjia

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wanglele87 at 2015-04-01 11:04:54
GST特异性比较好，一般过完是会比较纯的，可能会有一些单独的tag。不过我一般不会柱上切，回elute下来再切。分子筛一般纯化效果不好，除非蛋白分子量差别比较大，用来换buffer，一般作为最后一步纯化。楼主先换掉g ...

非常感谢你的回答，希望以后还可以请教你。
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5楼2015-04-01 19:55:18
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lirol

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tongqingjia: 金币+5, ★有帮助 2015-04-02 13:19:33
楼主有没有考虑过是蛋白不完全表达导致的杂带呢，大一点的tag好像会比较容易出现不完全表达的~另外过完柱子可以多用buffer洗洗的~
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6楼2015-04-02 11:01:23
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tongqingjia: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-04-02 13:26:24
本帖内容被屏蔽
7楼2015-04-02 11:20:50
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tongqingjia

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lirol at 2015-04-02 11:01:23
楼主有没有考虑过是蛋白不完全表达导致的杂带呢，大一点的tag好像会比较容易出现不完全表达的~另外过完柱子可以多用buffer洗洗的~

不完全表达是指不具有标签那种结合柱材料的能力的蛋白么？本来并非生物专业，希望耐心详细解答，非常感谢

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8楼2015-04-02 13:23:06
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tongqingjia

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mataomatao at 2015-04-02 11:20:50
控制结合时间和结合时的柱材料的量；还有就是没有切之前可弄纯了？如果后面没有降解之类的；目标蛋白除了回挂有没有其他比如分子筛分离？

好的，谢谢！我会采纳您的建议，我们是柱上切之后，将收集的蛋白液重新挂柱使标签除的更干净，其他分子筛之类的就没有用过了

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9楼2015-04-02 13:26:02
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lirol

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
tongqingjia: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-04-03 09:14:35
引用回帖:
8楼: Originally posted by tongqingjia at 2015-04-02 13:23:06
不完全表达是指不具有标签那种结合柱材料的能力的蛋白么？本来并非生物专业，希望耐心详细解答，非常感谢
...

你的需要的是GST-protein，但是表达出来的有可能是GST-part of protein，仍然是有结合beads的能力，所以后面有可能会很杂；我之前出现过这种情况，后来把诱导温度降低之后改善了很多~
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10楼2015-04-02 14:27:21
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