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tongqingjia

铜虫 (小有名气)

[求助] 蛋白质纯化 已有3人参与

研究的是带有GST标签的融合蛋白,柱上切收集的蛋白浓缩后(1ml左右),跑胶出现多条杂蛋白带,是不是蛋白液浓缩体积很少时,很多非目的蛋白的条带都会出现?急需指导,麻烦虫子们给予帮助吧,谢谢谢谢!
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lirol

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
tongqingjia: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-04-03 09:14:35
引用回帖:
8楼: Originally posted by tongqingjia at 2015-04-02 13:23:06
不完全表达是指不具有标签那种结合柱材料的能力的蛋白么?本来并非生物专业,希望耐心详细解答,非常感谢
...

你的需要的是GST-protein,但是表达出来的有可能是GST-part of protein,仍然是有结合beads的能力,所以后面有可能会很杂;我之前出现过这种情况,后来把诱导温度降低之后改善了很多~
10楼2015-04-02 14:27:21
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wanglele87

金虫 (著名写手)

这个问题我竟不知如何回答。不纯只能说过得亲和竹效果不好,再试试离子柱分子筛的看看吧

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

一生不羁放纵爱自由
2楼2015-04-01 09:41:31
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tongqingjia

铜虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wanglele87 at 2015-04-01 09:41:31
这个问题我竟不知如何回答。不纯只能说过得亲和竹效果不好,再试试离子柱分子筛的看看吧

柱材料是4FF,而且过夜结合,柱上切之后,将收集的蛋白重新反挂柱除去GST,是不是利用亲和柱纯化效果不如分子筛 之类的?
3楼2015-04-01 10:21:36
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wanglele87

金虫 (著名写手)

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-04-02 23:35:04
引用回帖:
3楼: Originally posted by tongqingjia at 2015-04-01 10:21:36
柱材料是4FF,而且过夜结合,柱上切之后,将收集的蛋白重新反挂柱除去GST,是不是利用亲和柱纯化效果不如分子筛 之类的?...

GST特异性比较好,一般过完是会比较纯的,可能会有一些单独的tag。不过我一般不会柱上切,回elute下来再切。分子筛一般纯化效果不好,除非蛋白分子量差别比较大,用来换buffer,一般作为最后一步纯化。楼主先换掉gsh,反挂下gst柱试试,不行的话试试离子柱。有的时候可能是蛋白折叠的问题,常常会粘一些杂蛋白,不好分开。

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一生不羁放纵爱自由
4楼2015-04-01 11:04:54
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