应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体相关
53/1返回列表
查看: 1923  |  回复: 25
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)

[求助] 连接载体相关 已有4人参与

最近一直在做连接，持续两个月了，每次都只长假菌落，基因三百多bp，连到了18T上，选择了BanHI和SpeI切（因为没有合适的酶切位点，在基因的非开放读码框处选择了SpeI）并回收，浓度不高大约10纳克左右。

连表达载体，问题就出现了，表达载体上这两个酶切位点距离较近中间只有一个XbaI，不知道是不是这个原因，不论是分别切还是直接双切的都连不上，而且分别切和直接双切后的载体不在一条线上，找了很多办法，为了防止假阳性甚至又将酶切后的载体去磷酸化，假阳性是少了可是没出真的。

用的都是1:3的比例，感受态用的是实验室做的Top10,虽说自己做的可能没有买的好，但是其他同学用也都连上了，我就不知道该怎么办了，请各位大神指点一二。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-03-29 19:41:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 18:07:28
不一定要单酶切位点，位点好的话有两个酶切位点的也可以，只要切够不影响连接就行了。
...

那样的话载体不切碎了吗
赞一下 回复此楼
23楼2015-03-30 19:17:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 26 个回答

xydjlove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:14
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？
赞一下 回复此楼
活在当下
2楼2015-03-29 21:51:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:17
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。可以加大酶切体系的体积，或者换一管酶。
你的T4连接可以常温连接过夜，如果仍然不行，也建议你换一罐T4
赞一下 回复此楼
3楼2015-03-29 23:04:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xydjlove at 2015-03-29 21:51:22
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？

刚开始做载体连接，当时还不知道会这样，现在不想改了，已经到连表达载体这步了，只想看看有没有什么方法，可以不换酶切位点的
赞一下 回复此楼
4楼2015-03-30 09:12:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 26 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-29 14:15 by jCd0dEvKHShX
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-29 13:41 by jCd0dEvKHShX
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:51 by jCd0dEvKHShX
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:29 by jCd0dEvKHShX
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +14 晴天加油 2026-08-26 15/750 2026-08-29 11:06 by biily
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-29 10:18 by winsaint
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭