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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pLent-puro-CMV建稳定高表达
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leilaye

铜虫 (小有名气)

[求助] pLent-puro-CMV建稳定高表达 已有2人参与

pLent-puro-CMV建稳定高表达细胞，用puro 筛选到第六天，突然细胞都死得差不多了，后来换成正常培养基，细胞也在死，状态很差救不活了。做了两次，一次质粒是氯化铯大提，一次是去毒素大提试剂盒做的质粒，质粒应该没有问题；
构建同时做了别的质粒，说明转染系统应该也没有问题。
请问大侠们，，咋回事呢？？？
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1楼 2015-03-24 19:39:10
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sc5921041

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没转进去吧。。。 你用什么转的？还是制得lentivirus? 转的什么细胞？ 你说的别的质粒是什么意思，别的质粒转进去了？
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nostalgia
2楼2015-03-25 04:16:15
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
leilaye: 金币+11, ★★★★★最佳答案 2015-03-25 21:25:05
1，转染也没问题的结论是你同时瞬转了其他质粒吗？有荧光标记的还是什么让你觉得没问题？
2，抽滤病毒用0.45还是0.22滤器？0.22会让一部分病毒失活。
3，puro筛6天的做法是怎样决定的？不知道你做的什么细胞。我感染的绝大部分细胞puro筛选不超过48小时（T47D最长96小时）。puro我用的是sigma的；也用过上海某s品牌的，真心不能用。建议同时做一个对照，没有感染过病毒的同种细胞，类似密度，同时加同样量的puro。当对照接近全死的时候立刻换液。不要等所谓的6天还是多少天。
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3楼2015-03-25 19:19:42
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leilaye

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by junior850621 at 2015-03-25 19:19:42
1，转染也没问题的结论是你同时瞬转了其他质粒吗？有荧光标记的还是什么让你觉得没问题？
2，抽滤病毒用0.45还是0.22滤器？0.22会让一部分病毒失活。
3，puro筛6天的做法是怎样决定的？不知道你做的什么细胞。我感 ...

稳转了pLKO的质粒，puro筛选一周，mda-mb-231死掉一半吧，mcf7不死，现在一个多星期了基本稳定，puro筛选不超过48小时，那就是以后培养过程中都不加puro吗？用的是0.22的滤器，换0.45的试试。谢谢
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4楼2015-03-25 21:24:40
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by leilaye at 2015-03-25 21:24:40
稳转了pLKO的质粒，puro筛选一周，mda-mb-231死掉一半吧，mcf7不死，现在一个多星期了基本稳定，puro筛选不超过48小时，那就是以后培养过程中都不加puro吗？用的是0.22的滤器，换0.45的试试。谢谢...

这两种细胞的稳转我都做过，都只做48小时即可。231我加到终浓度2微克/毫升,mcf-7我加到3.5微克/毫升。当然具体的量每个实验室不见的一样，你可以作参考。这样筛到的细胞pool都没有问题。我是以后基本都不加puromycin的，如果过年假期后回来复苏细胞可以再加一次，不过基本没有死的细胞。
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5楼2015-03-26 13:11:20
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leilaye

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by junior850621 at 2015-03-26 13:11:20
这两种细胞的稳转我都做过，都只做48小时即可。231我加到终浓度2微克/毫升,mcf-7我加到3.5微克/毫升。当然具体的量每个实验室不见的一样，你可以作参考。这样筛到的细胞pool都没有问题。我是以后基本都不加puromyc ...

谢谢
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6楼2015-03-27 08:53:55
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by leilaye at 2015-03-27 08:53:55
谢谢...

不客气。
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7楼2015-03-27 14:38:16
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