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2016zhu

新虫 (初入文坛)

[求助] 免疫亲和柱偶联抗体后无法截获标准品已有1人参与

我在做农药的免疫亲和柱时，为什么在Sepharose 4B上偶联抗体后，却无法捕获标准品？
    是不是抗体灵敏度太低了，就一定捕获不了标准品么？我的抗体灵敏度是2ppm左右，不管加多少抗体偶联免疫亲和柱，无论用5ppm还是0.5ppm标准品过柱子回收率都和不联抗体的空白柱子一样，这貌似是非特异性吸附吧。难道抗体一点作用都不起么？
    该怎么解决啊，谢谢大家了
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1楼2015-03-15 19:59:45
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Amanda燕尾蝶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
2016zhu: 金币+1, 抗体灵敏度低就一定捕获不了么？抗体偶联率很高，每次偶联都会测偶联率的 2015-03-29 16:33:02
抗体灵敏度低有影响。
你确定抗体偶联上胶了吗？
会不会洗脱太过了？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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我自横刀向天笑，笑完我就去睡觉。
2楼2015-03-28 10:51:37
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Amanda燕尾蝶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

可以测测抗体偶联率，确定下到底抗体联没连上，连上多少。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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我自横刀向天笑，笑完我就去睡觉。
3楼2015-03-28 10:54:03
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2016zhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Amanda燕尾蝶 at 2015-03-28 10:54:03
可以测测抗体偶联率，确定下到底抗体联没连上，连上多少。

抗体偶联率很高，每次都测过。您说会不会是抗体灵敏度太差，就一定捕获不了么？
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4楼2015-03-29 16:31:52
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2016zhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Amanda燕尾蝶 at 2015-03-28 10:54:03
可以测测抗体偶联率，确定下到底抗体联没连上，连上多少。

抗体偶联率都测过，偶联率很高，但是就是捕获不了
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5楼2015-03-29 16:38:01
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2016zhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Amanda燕尾蝶 at 2015-03-28 10:51:37
抗体灵敏度低有影响。
你确定抗体偶联上胶了吗？
会不会洗脱太过了？

抗体灵敏度低就一定捕获不了么？抗体偶联率很高，每次偶联都会测偶联率的
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6楼2015-03-29 16:38:25
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Amanda燕尾蝶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
2016zhu: 金币+1, 谢谢 2015-03-30 08:17:42
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4楼: Originally posted by 2016zhu at 2015-03-29 16:31:52
抗体偶联率很高，每次都测过。您说会不会是抗体灵敏度太差，就一定捕获不了么？...

灵敏度差也不该一点也捕获不了啊。你是怎么确定捕获不了的？不是洗涤过了吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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我自横刀向天笑，笑完我就去睡觉。
7楼2015-03-29 21:29:19
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2016zhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Amanda燕尾蝶 at 2015-03-29 21:29:19
灵敏度差也不该一点也捕获不了啊。你是怎么确定捕获不了的？不是洗涤过了吗？
...

就是我用不联抗体的柱子和偶联过抗体的柱子做对比，差别不大，貌似都是材料的非特异性吸附。不管添加多大标准品进行添加回收，最后都是截获1/5左右，怎么洗也洗不干净
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8楼2015-03-30 08:17:16
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Amanda燕尾蝶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
2016zhu: 金币+1 2015-03-31 08:08:15
我能想到的几点原因：1抗体连上胶后影响特异性，连胶的反应体系问题
                              2抗体与标准品反应时的缓冲体系不适合
                             3抗体和标准品反应时间太短，没有孵育完全就被洗掉了
                              4洗杂的时候力度过大，洗涤液可以再优化优化
ps我就做过一点点，不是特别懂。挑着有用的看吧
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我自横刀向天笑，笑完我就去睡觉。
9楼2015-03-30 09:22:51
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2016zhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Amanda燕尾蝶 at 2015-03-30 09:22:51
我能想到的几点原因：1抗体连上胶后影响特异性，连胶的反应体系问题
                              2抗体与标准品反应时的缓冲体系不适合
                             3抗体和标准品反应时间太短，没有孵育完全 ...

非常感谢
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10楼2015-03-31 08:05:35
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