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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教：载体怎样连接？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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playboy723

金虫 (正式写手)

[交流] 请教：载体怎样连接？

各位高手：请教一个问题，我这几天正在连接一个载体  片段有1500bp 双酶切  两端的酶切位点分别是BamH1和Xho1    我将片段和载体分别酶切、回收后进行连接  （应该切开了 因为同时做的另一个基因连上了） 连接的条件为：片段与载体比例为10：1   根据摩尔浓度算的   然后16度3小时以上  之后转化    结果没有插进去（虽然有阳性克隆  但挑了40多个克隆 都是假阳性和自连）  但同时做的另一个基因700多bp却挑出很多阳性克隆来   所以我想请教一下 ：是否插入的片段越大连接越困难？  >1500bp的片段连接条件是怎样的？  或者还有其他的要求和问题我没有注意到  请各位高手不吝赐教  我都快烦死了  谢谢了
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1楼 2008-06-11 19:29:07
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yaoyaochong

银虫 (正式写手)
同命相连呀，我也是死活做不出来，我现在都开始怀疑一个3.6Kb 一个4.3 Kb的两个片段是不是能连起来，做了好几次了，都是出不来，不知道该怎么办了，明天再转一次，看看怎么样，不知道像两个这么大的片段，需要连接多长时间，过夜够了吧
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7楼2008-06-12 20:13:19
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yangym1123

木虫 (小有名气)
★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):个人经验分享，谢谢
的确如此，片段越大，越是难以连接上，所以要连接上要保证插入片段的量足够多（浓度高），载体的量是要足够多，不知道你做连接的体系哦。我们做载体构建时，载体要100ng，插入片段也是较多，在调整一下吧！连接时间过夜试一下呢，我们都是16度，16小时，或者四度16小时！祝你好运哦！
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2楼2008-06-11 19:38:56
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jiwu20

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
载体要100ng，插入片段也是较多，在调整一下吧！连接时间过夜试一下呢，我们都是16度，6小时，或者四度16小时！



载体要这么多吗？越多自连率越高，楼主写错了吧
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3楼2008-06-12 11:53:04
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jiwu20

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):积极交流奖
引用回帖:
Originally posted by playboy723 at 2008-6-11 19:29:
各位高手：请教一个问题，我这几天正在连接一个载体  片段有1500bp 双酶切  两端的酶切位点分别是BamH1和Xho1    我将片段和载体分别酶切、回收后进行连接  （应该切开了 因为同时做的另一个基因连上了） 连接的条 ...

1、另一个基因两酶切位点是BamH1和Xho1？   吗。如果不是就不能说明问题。

2、如果是，建议用碱性磷酸酶处理一下载体，防止自连。试试吧。
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4楼2008-06-12 11:58:38
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