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月月大可木虫 (著名写手)
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测序不一致问题
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今天收到基因公司的测序报告，发现问题很大，请各位虫友帮忙分析。 我通过PCR获得片段A（1.2kb）和B（1.5kb），然后通过重叠PCR（overlap PCR）将两个片段连接起来，再和T载体连接。将A＋B＋T载体送基因公司测序。拿测序报告和我原有的序列比对发现A和B中都有不少单个碱基不一致的地方，并且在B的后半部分有长达十几bp的缺失。我PCR所使用的酶均为pfu高保真酶。 请虫友帮忙分析一下，谢谢！！ |
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2楼2008-06-05 21:59:19
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Overlap PCR（重叠PCR） 重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。A的序列为5-atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5-atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为： A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3 A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。我们来看重叠PCR的步骤： （1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因 （2）回收A，B基因 （3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A＋B呢？因为我们在设计引物的时候使A，B有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出A+B. 第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应，好处是节省时间，不太麻烦。 |
5楼2008-06-06 12:53:15
月月大可
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