| 查看: 446 | 回复: 6 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
月月大可木虫 (著名写手)
|
[交流]
测序不一致问题
|
||
|
今天收到基因公司的测序报告，发现问题很大，请各位虫友帮忙分析。 我通过PCR获得片段A（1.2kb）和B（1.5kb），然后通过重叠PCR（overlap PCR）将两个片段连接起来，再和T载体连接。将A＋B＋T载体送基因公司测序。拿测序报告和我原有的序列比对发现A和B中都有不少单个碱基不一致的地方，并且在B的后半部分有长达十几bp的缺失。我PCR所使用的酶均为pfu高保真酶。 请虫友帮忙分析一下，谢谢！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
求调剂 有机化学考研356分
已经有4人回复
-
0703 化学 求调剂，一志愿山东大学 342 分
已经有4人回复
-
086000生物与医药调剂
已经有7人回复
-
305求调剂
已经有7人回复
-
348求调剂
已经有3人回复
-
332求调剂
已经有6人回复
-
各位老师好，我的一志愿为北京科技大学085601材料专硕
已经有6人回复
-
085600 材料与化工 329分求调剂
已经有10人回复
-
356求调剂
已经有3人回复
-
一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。
已经有7人回复
hulqi
金虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1144.2
- 散金: 106
- 红花: 4
- 帖子: 361
- 在线: 56小时
- 虫号: 568420
- 注册: 2008-06-03
- 专业: 微生物资源与分类学
3楼2008-06-05 23:17:50
superarm
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2000
- 散金: 18
- 帖子: 632
- 在线: 226.3小时
- 虫号: 560892
- 注册: 2008-05-20
- 性别: GG
- 专业: 水产生物遗传育种学
2楼2008-06-05 21:59:19
4楼2008-06-06 08:55:53
月月大可
木虫 (著名写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 3272.1
- 散金: 1393
- 红花: 17
- 帖子: 1674
- 在线: 295.7小时
- 虫号: 549127
- 注册: 2008-04-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
|
Overlap PCR（重叠PCR） 重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。A的序列为5-atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5-atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为： A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3 A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。我们来看重叠PCR的步骤： （1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因 （2）回收A，B基因 （3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A＋B呢？因为我们在设计引物的时候使A，B有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出A+B. 第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应，好处是节省时间，不太麻烦。 |
5楼2008-06-06 12:53:15
10
