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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

[交流] TA克隆能直接用于表达载体吗?

我们实验室采用的常规方法是将PCR产物先利用TA克隆插入T载体,在从T载切下插入pET表达载体.
但是发现实验室保藏的pET29a(+)中同样有EcoRV酶切位点.于是向请教大家能否直接将PCR产物纯化后利用TA克隆一步插入到pET29a(+)表达载体?!有没有哪位朋友试过,效果怎样?
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11014612

银虫 (初入文坛)

★ ★
tcxuefeng(金币+2,VIP+0):谢谢讨论
不好吧 如果那样的话就没办法定向可隆了,而且连到表达载体后一般还要测序验证
2楼2008-06-03 21:16:27
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

谢谢.但是与常规构建表达载体的繁琐相比,TA克隆的高效性是否使得足以接受非定向克隆的缺点?
因为最早单酶切构建不也能够接受吗?
用表达载体直接TA克隆的可行性到底有多大呢.欢迎大家继续指点.
3楼2008-06-03 21:46:57
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zhouyj

木虫 (正式写手)

★ ★
tcxuefeng(金币+2,VIP+0):谢谢.
单酶切插入要考虑方向问题
并且可能会造成移码突变
建议楼主你在PCR引物中设计酶切位点,然后纯化直接酶切,和载体连接,省掉TA克隆,我们都是这样做的
有朋友们的支持,在学术道路上才不会寂寞
4楼2008-06-03 22:18:35
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mimisikai

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★ ★
tcxuefeng(金币+6,VIP+0):谢谢你.是我搞错了.我以为T载是环状的
不可以。T载体用是EcoRV位点 但其是切开后加T了 难道你也把pet-29切开 再加T?
不要省事,否则反而费时。
5楼2008-06-03 23:35:25
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maria229

木虫 (著名写手)

我用的transgen公司的pEASY-E1载体就是利用TA原理设计的表达载体,虽然不是pET29a(+),但是也是His标签的,直接连接后就能表达了,很好用的。他们还有E2,区别是His tag的位置不同。
6楼2008-06-04 18:37:57
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

谢谢楼上的朋友.
在请教,你用的这个载体价格如何?具体怎么购买呢.
7楼2008-06-05 09:10:51
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maria229

木虫 (著名写手)

20ul 几百块钱(不好意思,忘记具体数了),是北京全式金生物技术公司,电话是010-51296890,还有一个咨询热线 400-716-9321

好像有折扣的,祝你试验成功
8楼2008-06-11 09:18:13
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

谢谢你,朋友!
9楼2008-06-13 08:34:53
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ice-2008

金虫 (小有名气)

主要还是定向的问题吧
10楼2008-06-16 06:49:05
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