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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » TA克隆能直接用于表达载体吗?
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

[交流] TA克隆能直接用于表达载体吗?

我们实验室采用的常规方法是将PCR产物先利用TA克隆插入T载体,在从T载切下插入pET表达载体.
但是发现实验室保藏的pET29a(+)中同样有EcoRV酶切位点.于是向请教大家能否直接将PCR产物纯化后利用TA克隆一步插入到pET29a(+)表达载体?!有没有哪位朋友试过,效果怎样?
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1楼 2008-06-03 21:13:36
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mimisikai

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
tcxuefeng(金币+6,VIP+0):谢谢你.是我搞错了.我以为T载是环状的
不可以。T载体用是EcoRV位点 但其是切开后加T了 难道你也把pet-29切开 再加T？
不要省事，否则反而费时。
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5楼2008-06-03 23:35:25
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11014612

银虫 (初入文坛)
★ ★
tcxuefeng(金币+2,VIP+0):谢谢讨论
不好吧 如果那样的话就没办法定向可隆了，而且连到表达载体后一般还要测序验证
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2楼2008-06-03 21:16:27
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)
谢谢.但是与常规构建表达载体的繁琐相比,TA克隆的高效性是否使得足以接受非定向克隆的缺点?
因为最早单酶切构建不也能够接受吗?
用表达载体直接TA克隆的可行性到底有多大呢.欢迎大家继续指点.
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3楼2008-06-03 21:46:57
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zhouyj

木虫 (正式写手)
★ ★
tcxuefeng(金币+2,VIP+0):谢谢.
单酶切插入要考虑方向问题
并且可能会造成移码突变
建议楼主你在PCR引物中设计酶切位点，然后纯化直接酶切，和载体连接，省掉TA克隆，我们都是这样做的
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有朋友们的支持，在学术道路上才不会寂寞
4楼2008-06-03 22:18:35
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