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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

[交流] 求助引物设计问题

最近新上手设计引物,有以下几个疑问:

1 引物Tm值到底算不算酶切位点和保护碱基?我设计了一对如果算上这些,那上下游Tm完全一样;但是不算,差了28度......B)

2 如果是用TA克隆,那设计的酶切位点是否有需要加保护碱基?因为之后转表达载体时双酶切不是在T载体上切,而T载体上害怕保护碱基不够长吗?

3 Nde I作为上游引物酶切位点的优点在于切出来直接是ATG.可是这个优点到底有什么好处?

希望各位朋友指教谢谢
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张力民

铜虫 (小有名气)


tcxuefeng(金币+1,VIP+0):谢谢你朋友.但是真的可以不加酶切位点吗?我之后要再构建到表达载体上啊.难道可以从T载的MCS上切下然后加到PET上吗?这样不会多出来一段肽段吗?
TA连接应该不用加保护碱基,也不用加酶切位点,因为T载体会带酶切位点。
2楼2008-06-03 12:34:32
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synhily

木虫 (正式写手)


tcxuefeng(金币+1,VIP+0):谢谢你朋友.可是关于这个问题似乎众说纷纭啊.我这边有两个实验室算,两个不算.呵呵.我也糊涂了.看来只好尽量都凑了
Tm值不算酶切位点和保护碱基。所以,你设计好了一段引物以后不要考虑其它的就可以了。否则,退火温度和GC含量会有很大变化的。
3楼2008-06-03 12:45:04
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 张力民 at 2008-6-3 12:34:
TA连接应该不用加保护碱基,也不用加酶切位点,因为T载体会带酶切位点。

谢谢你朋友.但是真的可以不加酶切位点吗?我之后要再构建到表达载体上啊.难道可以从T载的MCS上切下然后加到PET上吗?这样不会多出来一段肽段吗?
4楼2008-06-03 17:08:05
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张力民

铜虫 (小有名气)


tcxuefeng(金币+1,VIP+0):谢谢你
多出来的应该影响不大
5楼2008-06-03 18:29:45
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

还是希望能得到更多朋友的帮助.
谢谢
6楼2008-06-03 20:37:04
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zhouyj

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
tcxuefeng(金币+7,VIP+0):谢谢你朋友.
1、引物应该算酶切位点和保护碱基,因为在PCR过程中第二轮以后引物和片段就完全配对了
2、TA克隆不用加保护碱基,当然更简便的方法是你可以PCR后,直接酶切连接,而不用经过TA克隆
3、NdeI切出来有ATG,可以不用你片段的起始密码子,可增加引物和片段的配对碱基数量,有利于特异性接合,但Nde I效率比较低

[ Last edited by zhouyj on 2008-6-6 at 08:36 ]
有朋友们的支持,在学术道路上才不会寂寞
7楼2008-06-03 22:07:54
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jerome711

银虫 (小有名气)

楼上回答的切中要害。学习了。
做懂得生活的人
8楼2008-06-04 15:22:57
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lqg127

引物应该算酶切位点和保护碱基,因为在PCR过程中第二轮以后引物和片段就完全配对了
9楼2008-07-01 14:56:23
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jasco

木虫 (正式写手)

1. 两种tm值都要考虑,我的经验是,不加酶切位点和保护碱基的tm值的匹配更重要。楼主不加酶切位点和保护碱基的tm值差了28度,pcr会困难很多。
2. 同意zhouyj
3. 补充: Nde I最好加上4-6个保护碱基,还有就是neb的酶会好很多
10楼2008-07-01 17:15:52
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