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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助引物设计问题
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

[交流] 求助引物设计问题

最近新上手设计引物,有以下几个疑问:

1 引物Tm值到底算不算酶切位点和保护碱基?我设计了一对如果算上这些,那上下游Tm完全一样;但是不算,差了28度......B)

2 如果是用TA克隆,那设计的酶切位点是否有需要加保护碱基?因为之后转表达载体时双酶切不是在T载体上切,而T载体上害怕保护碱基不够长吗?

3 Nde I作为上游引物酶切位点的优点在于切出来直接是ATG.可是这个优点到底有什么好处?

希望各位朋友指教谢谢
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1楼 2008-06-03 11:52:00
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张力民

铜虫 (小有名气)
★
tcxuefeng(金币+1,VIP+0):谢谢你朋友.但是真的可以不加酶切位点吗?我之后要再构建到表达载体上啊.难道可以从T载的MCS上切下然后加到PET上吗?这样不会多出来一段肽段吗?
TA连接应该不用加保护碱基，也不用加酶切位点，因为T载体会带酶切位点。
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2楼2008-06-03 12:34:32
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synhily

木虫 (正式写手)
★
tcxuefeng(金币+1,VIP+0):谢谢你朋友.可是关于这个问题似乎众说纷纭啊.我这边有两个实验室算,两个不算.呵呵.我也糊涂了.看来只好尽量都凑了
Tm值不算酶切位点和保护碱基。所以，你设计好了一段引物以后不要考虑其它的就可以了。否则，退火温度和GC含量会有很大变化的。
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3楼2008-06-03 12:45:04
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 张力民 at 2008-6-3 12:34:
TA连接应该不用加保护碱基，也不用加酶切位点，因为T载体会带酶切位点。

谢谢你朋友.但是真的可以不加酶切位点吗?我之后要再构建到表达载体上啊.难道可以从T载的MCS上切下然后加到PET上吗?这样不会多出来一段肽段吗?
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4楼2008-06-03 17:08:05
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张力民

铜虫 (小有名气)
★
tcxuefeng(金币+1,VIP+0):谢谢你
多出来的应该影响不大
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5楼2008-06-03 18:29:45
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)
还是希望能得到更多朋友的帮助.
谢谢
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6楼2008-06-03 20:37:04
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zhouyj

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
tcxuefeng(金币+7,VIP+0):谢谢你朋友.
1、引物应该算酶切位点和保护碱基，因为在PCR过程中第二轮以后引物和片段就完全配对了
2、TA克隆不用加保护碱基，当然更简便的方法是你可以PCR后，直接酶切连接，而不用经过TA克隆
3、NdeI切出来有ATG，可以不用你片段的起始密码子，可增加引物和片段的配对碱基数量，有利于特异性接合，但Nde I效率比较低

[ Last edited by zhouyj on 2008-6-6 at 08:36 ]
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有朋友们的支持，在学术道路上才不会寂寞
7楼2008-06-03 22:07:54
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jerome711

银虫 (小有名气)
楼上回答的切中要害。学习了。
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做懂得生活的人
8楼2008-06-04 15:22:57
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lqg127

引物应该算酶切位点和保护碱基，因为在PCR过程中第二轮以后引物和片段就完全配对了
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9楼2008-07-01 14:56:23
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jasco

木虫 (正式写手)
1. 两种tm值都要考虑，我的经验是，不加酶切位点和保护碱基的tm值的匹配更重要。楼主不加酶切位点和保护碱基的tm值差了28度，pcr会困难很多。
2. 同意zhouyj
3. 补充： Nde I最好加上4-6个保护碱基，还有就是neb的酶会好很多
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10楼2008-07-01 17:15:52
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