应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 连接转化
91/1返回列表
查看: 2197  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化 已有4人参与

本人刚接触分子实验不久，还处于摸索阶段，反复实验遇到相同的问题，请路过的各位师兄师姐能不吝赐教，在下感激不尽。。。。
试验中 我提取材料的RNA反转录之后，PCR克隆出全长，如图00：MARKER条带七条，依次是100 250 500 750 1000 1500 2000  我的基因全长1300多bp,切胶回收后用PMD18-T进行连接，连接体系10ul  为（pcr回收产物4.5ul，PMD18-T 0.5ul，solutionI 5ul)，16度连接4小时，因为曾经做过16度4小时并没有连接上，所以又做了一组16度连接了13个小时，继续涂板转化，均长出菌落，挑菌摇菌后10个小时，也变混浊，但是做菌液pcr检测的结果却是弥散，同时做的另一个基因却做的很好。图11是16度连接4个小时的菌液pcr，图22是连接13个小时的菌液pcr，请大家帮忙看看到底是我哪里出了问题？（抱拳）

连接转化
11.jpg


连接转化-1
22.jpg


连接转化-2
00.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2015-01-11 10:25:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-11 15:32:18
建议你把质粒提出来跑电泳，再以质粒做模板扩增验证一下

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2015-01-11 10:46:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-11 15:32:27
建议重新扩增基因片段。回收之后再做检测，确定目的片段后，再做连接转化，稳妥些。从这个结果看，我不认为你扩增出来了可用以连接的目的片段。若目的基因没问题，那再看连接转化的细节把握。
赞一下 回复此楼
3楼2015-01-11 13:29:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangbighui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议换个T载体，什么年代了还用18-T，效率低时间长，可以考虑全氏金的blunt sample T载体，T-3载体。再者，可考虑提取质粒酶切鉴定，PCR鉴定假阳性太多。
赞一下 回复此楼
成功，就是成为你想成为的人
4楼2015-01-11 19:47:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

叶叶梦

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目的基因没有连接上，本人觉得换种连接载体试试，或者你的菌落再提个质粒看看是不是已经有目的基因了，
赞一下 回复此楼
5楼2015-01-13 22:04:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cuihao102 at 2015-01-11 10:46:00
建议你把质粒提出来跑电泳，再以质粒做模板扩增验证一下

谢谢，挑选几个提质粒依旧没条带，换了另外一种载体，做了40个才得到一个有条带的，还是很谢谢你的回答~~
赞一下 回复此楼
6楼2015-01-29 09:09:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-11 13:29:29
建议重新扩增基因片段。回收之后再做检测，确定目的片段后，再做连接转化，稳妥些。从这个结果看，我不认为你扩增出来了可用以连接的目的片段。若目的基因没问题，那再看连接转化的细节把握。

应该是载体不合适，换了一种载体，艰难的得到了一个有条带的，谢谢你的回复~~
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2015-01-29 09:10:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangbighui at 2015-01-11 19:47:26
建议换个T载体，什么年代了还用18-T，效率低时间长，可以考虑全氏金的blunt sample T载体，T-3载体。再者，可考虑提取质粒酶切鉴定，PCR鉴定假阳性太多。

谢谢，果然是载体的问题，换了一种载体，终于在40个样中有一个出现了条带~
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2015-01-29 09:11:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 叶叶梦 at 2015-01-13 22:04:42
目的基因没有连接上，本人觉得换种连接载体试试，或者你的菌落再提个质粒看看是不是已经有目的基因了，

嗯嗯，确实是载体的问题，换了一种载体，现在菌液Pcr跑出有条带的了~谢谢
赞一下 回复此楼
9楼2015-01-29 09:12:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xuxiaoxianer 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +3 Tide man 2026-08-10 3/150 2026-08-10 21:48 by GZUZM
[基金申请] FileCode能看出啥？ +7 要乐观耀哥 2026-08-10 15/750 2026-08-10 19:29 by 要乐观耀哥
[基金申请] filecode +8 documentary 2026-08-10 8/400 2026-08-10 19:20 by loufangrui
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 11/550 2026-08-10 17:09 by 六两废铜
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +3 majunge000 2026-08-10 3/150 2026-08-10 15:46 by lch2012
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +14 Lanmanbaby 2026-08-09 22/1100 2026-08-10 14:57 by wwncly
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +11 archvillain 2026-08-04 13/650 2026-08-10 14:41 by seekfind
[基金申请] 好奇怪的filecode +4 布布和一二 2026-08-08 5/250 2026-08-10 14:20 by 冰心玉壶晴
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭