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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 连接转化
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xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化 已有4人参与

本人刚接触分子实验不久，还处于摸索阶段，反复实验遇到相同的问题，请路过的各位师兄师姐能不吝赐教，在下感激不尽。。。。
试验中 我提取材料的RNA反转录之后，PCR克隆出全长，如图00：MARKER条带七条，依次是100 250 500 750 1000 1500 2000  我的基因全长1300多bp,切胶回收后用PMD18-T进行连接，连接体系10ul  为（pcr回收产物4.5ul，PMD18-T 0.5ul，solutionI 5ul)，16度连接4小时，因为曾经做过16度4小时并没有连接上，所以又做了一组16度连接了13个小时，继续涂板转化，均长出菌落，挑菌摇菌后10个小时，也变混浊，但是做菌液pcr检测的结果却是弥散，同时做的另一个基因却做的很好。图11是16度连接4个小时的菌液pcr，图22是连接13个小时的菌液pcr，请大家帮忙看看到底是我哪里出了问题？（抱拳）

连接转化
11.jpg


连接转化-1
22.jpg


连接转化-2
00.jpg
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1楼 2015-01-11 10:25:37
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-11 15:32:18
建议你把质粒提出来跑电泳，再以质粒做模板扩增验证一下

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2楼2015-01-11 10:46:00
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-11 15:32:27
建议重新扩增基因片段。回收之后再做检测，确定目的片段后，再做连接转化，稳妥些。从这个结果看，我不认为你扩增出来了可用以连接的目的片段。若目的基因没问题，那再看连接转化的细节把握。
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3楼2015-01-11 13:29:29
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zhangbighui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议换个T载体，什么年代了还用18-T，效率低时间长，可以考虑全氏金的blunt sample T载体，T-3载体。再者，可考虑提取质粒酶切鉴定，PCR鉴定假阳性太多。
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成功，就是成为你想成为的人
4楼2015-01-11 19:47:26
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叶叶梦

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目的基因没有连接上，本人觉得换种连接载体试试，或者你的菌落再提个质粒看看是不是已经有目的基因了，
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5楼2015-01-13 22:04:42
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xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cuihao102 at 2015-01-11 10:46:00
建议你把质粒提出来跑电泳，再以质粒做模板扩增验证一下

谢谢，挑选几个提质粒依旧没条带，换了另外一种载体，做了40个才得到一个有条带的，还是很谢谢你的回答~~
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6楼2015-01-29 09:09:23
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xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-11 13:29:29
建议重新扩增基因片段。回收之后再做检测，确定目的片段后，再做连接转化，稳妥些。从这个结果看，我不认为你扩增出来了可用以连接的目的片段。若目的基因没问题，那再看连接转化的细节把握。

应该是载体不合适，换了一种载体，艰难的得到了一个有条带的，谢谢你的回复~~
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7楼2015-01-29 09:10:31
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xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangbighui at 2015-01-11 19:47:26
建议换个T载体，什么年代了还用18-T，效率低时间长，可以考虑全氏金的blunt sample T载体，T-3载体。再者，可考虑提取质粒酶切鉴定，PCR鉴定假阳性太多。

谢谢，果然是载体的问题，换了一种载体，终于在40个样中有一个出现了条带~
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8楼2015-01-29 09:11:25
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xuxiaoxianer

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 叶叶梦 at 2015-01-13 22:04:42
目的基因没有连接上，本人觉得换种连接载体试试，或者你的菌落再提个质粒看看是不是已经有目的基因了，

嗯嗯，确实是载体的问题，换了一种载体，现在菌液Pcr跑出有条带的了~谢谢
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9楼2015-01-29 09:12:21
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