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求问怎样查找比较偏门的菌类的基因相应的cDNA并在此基础上RT-PCR设计引物，多谢已有2人参与
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之前在网上查过各种利用NCBI查找cDNA、设计引物的教程，但是不知道是我的问题还是查的不对，依然还是各种查不到 实验室曾经会设计引物的师兄毕业了，问了一圈都没有特别懂的，还望各位大神相助T^T 具体如下： 想要查找的基因是hmgs（HMG-coA合酶），参考的文献里cDNA的来源是Phycomyces这个菌，文献里有句原文是： A fragment of hmgS was obtained by PCR using Phycomyces cDNA as template, together with a set of primers designed to anneal to conserved areas of the gene: HS-2 (5’-GGNAAATA-TACNATHGG-3’, corresponding to the amino acid sequence GKYTIG) and HS-3 (5’-AAATCRTANGCRTGYTGCAT-3’, aa sequence MQHAYDF). 文献上这里的引物我没太看懂……不过作者不是做的RT-PCR，是做的Northern。 于是我是想找到Phycomyces的hmgs对应的cDNA序列，再来根据cDNA设计RT-PCR的引物 但是不知道该怎么找到Phycomyces的相关cDNA，在NCBI上找了下发现可选目录里都没Phycomyces这个菌T^T 然后我看到，依然是该文献里，提到了这么一句： The rest of the gene was obtained by inverse PCR and sequenced to assemble a 2528-bp DNA segment containing the Phycomyces hmgS gene and its flanking regions (EMBL Accession No. AJ297414). 于是我想查一下EMBL试试，但是发现根本进不了这个网站，于是又不知道该怎么做了T^T 以上就是全部问题，还望各位能帮忙看看还有什么查找方法，万分感谢T^T |
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 分子生物 |
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liuderong
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【答案】应助回帖
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你贴出来的文献其实已经把方法说得很清楚了，只是一些关键的地方你暂时还理解不了。我觉得你首先要做的不是找序列，你说的物种没有测序，通常情况下是没有序列的，谁都找不到！你要做的应该是上百度找一些“简并引物”相关的资料，看别人是怎么设计引物的，或者到你们图书馆借一些相关的书看看，看过之后再看文献，你自然就明白了。 你贴出的文献里说引物时特别提到“ corresponding to the amino acid sequence GKYTIG”，这是一个很关键的地方，你看过简并引物资料后应该会明白，明白这个应该就知道往后怎么做实验了。 最后祝你好运啊！还是要有点运气实验才能成功的。 |
4楼2015-01-08 20:12:42
liuderong
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有DNA序列的话就可以试试看用blastx来找到cDNA，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Bl ... LAST_INIT=blast2seq，找一些其他物种的hmgs蛋白和这个物种的hmgs基因比对，根据匹配情况可以推断大致的开放阅读框。 |
6楼2015-01-09 08:43:18