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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求问怎样查找比较偏门的菌类的基因相应的cDNA并在此基础上RT-PCR设计引物，多谢
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gumimimi

新虫 (初入文坛)

[求助] 求问怎样查找比较偏门的菌类的基因相应的cDNA并在此基础上RT-PCR设计引物，多谢已有2人参与

之前在网上查过各种利用NCBI查找cDNA、设计引物的教程，但是不知道是我的问题还是查的不对，依然还是各种查不到
实验室曾经会设计引物的师兄毕业了，问了一圈都没有特别懂的，还望各位大神相助T^T

具体如下：
想要查找的基因是hmgs（HMG-coA合酶），参考的文献里cDNA的来源是Phycomyces这个菌，文献里有句原文是：
A fragment of hmgS was obtained by PCR using Phycomyces cDNA as template, together with a set of primers designed to anneal to conserved areas of the gene: HS-2 (5’-GGNAAATA-TACNATHGG-3’, corresponding to the amino acid sequence GKYTIG) and HS-3 (5’-AAATCRTANGCRTGYTGCAT-3’, aa sequence MQHAYDF).
文献上这里的引物我没太看懂……不过作者不是做的RT-PCR，是做的Northern。

于是我是想找到Phycomyces的hmgs对应的cDNA序列，再来根据cDNA设计RT-PCR的引物
但是不知道该怎么找到Phycomyces的相关cDNA，在NCBI上找了下发现可选目录里都没Phycomyces这个菌T^T

然后我看到，依然是该文献里，提到了这么一句：
The rest of the gene was obtained by inverse PCR and sequenced to assemble a 2528-bp DNA segment containing the Phycomyces hmgS gene and its flanking regions
(EMBL Accession No. AJ297414).
于是我想查一下EMBL试试，但是发现根本进不了这个网站，于是又不知道该怎么做了T^T

以上就是全部问题，还望各位能帮忙看看还有什么查找方法，万分感谢T^T
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1楼2015-01-07 21:40:14
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2015-01-07 22:50:07
你可以在ncbi上搜索啊，输入基因名字会有很多的资源，你看哪一个是必须要的物种
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2楼2015-01-07 21:51:09
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gumimimi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2015-01-07 21:51:09
你可以在ncbi上搜索啊，输入基因名字会有很多的资源，你看哪一个是必须要的物种

搜过，不过我NCBI用的也不熟，搜这个基因时物种来源里没搜到霉菌相关的，就几个酵母。
我是想找霉菌的，这才查到的这篇文献，但是Phycomyces这个菌我在NCBI也没找到。
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3楼2015-01-07 22:12:55
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你贴出来的文献其实已经把方法说得很清楚了，只是一些关键的地方你暂时还理解不了。我觉得你首先要做的不是找序列，你说的物种没有测序，通常情况下是没有序列的，谁都找不到！你要做的应该是上百度找一些“简并引物”相关的资料，看别人是怎么设计引物的，或者到你们图书馆借一些相关的书看看，看过之后再看文献，你自然就明白了。

你贴出的文献里说引物时特别提到“ corresponding to the amino acid sequence GKYTIG”，这是一个很关键的地方，你看过简并引物资料后应该会明白，明白这个应该就知道往后怎么做实验了。

最后祝你好运啊！还是要有点运气实验才能成功的。
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4楼2015-01-08 20:12:42
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gumimimi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuderong at 2015-01-08 20:12:42
你贴出来的文献其实已经把方法说得很清楚了，只是一些关键的地方你暂时还理解不了。我觉得你首先要做的不是找序列，你说的物种没有测序，通常情况下是没有序列的，谁都找不到！你要做的应该是上百度找一些“简并引物 ...

非常感谢您！我回去再去找找相关资料看下。其实Phycomyces的hmgs的DNA序列能在NCBI上找到，但是找不到对应的cDNA序列，于是就很苦恼了……不管怎么说还是多谢您！
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5楼2015-01-09 01:19:17
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gumimimi at 2015-01-09 01:19:17
非常感谢您！我回去再去找找相关资料看下。其实Phycomyces的hmgs的DNA序列能在NCBI上找到，但是找不到对应的cDNA序列，于是就很苦恼了……不管怎么说还是多谢您！...

有DNA序列的话就可以试试看用blastx来找到cDNA，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Bl ... LAST_INIT=blast2seq，找一些其他物种的hmgs蛋白和这个物种的hmgs基因比对，根据匹配情况可以推断大致的开放阅读框。
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6楼2015-01-09 08:43:18
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gumimimi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liuderong at 2015-01-09 08:43:18
有DNA序列的话就可以试试看用blastx来找到cDNA，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=blastn& ...

再次感谢> <是说对比后找到与我想要的菌比较近缘的物种后再查这些物种hmgs的cDNA吗？还是根据推断的ORF来设计？
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7楼2015-01-09 17:57:30
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