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提过蛋白的大牛快请进啊！ 已有2人参与
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| 蛋白大牛们，想请教一个小问题~ 我提了protein打算做EMSA，如果我提的protein是个dimer，那么在buffer里蛋白可能有monomer状态的么？多谢了！！！（我的emsa结果显示，被蛋白binding的DNA有4条带，但是DNase I footprinting显示被binding的DNA序列只可能bind一个protein dimer，所以会不会有单体状态的protein结合到了DNA上？这样的话，有dimer和monomer分别bind到DNA上，所以形成了4条带？） |
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【答案】应助回帖
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三点提示： 1.DNA与蛋白质相互作用的直接作用区域最好的确定方法是ChIP，而且ChIP能够在细胞原位上侦测出DNA-蛋白质的特异性的结合位点。因为DNase I footprinting因为蛋白质的体积比较大，影响了酶切，所以精确的作用位点不好确定。 2.不知道你的蛋白质亚基之间的交联剂是什么，有些交联剂有手臂，加上起反应的缓冲溶液条件，可能会撑开不同的亚基或者多交连一些亚基（后者比如戊二醛）。我建议还是先使用分子筛层析，在接近生理条件下检测蛋白质的亚基构成，并且分离出来。 3.凝胶阻滞电泳中可能有新的结合蛋白质的序列，这不奇怪，因为蛋白质在细胞中一般与DNA可能有特异性的结合序列，也同时会有一些非特异性的结合序列，两者结合力不同，而且有时还与其他的蛋白质的调控有关。 |
6楼2014-12-30 11:12:51
2楼2014-12-29 19:28:47
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3楼2014-12-30 00:11:01
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【答案】应助回帖
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怎么用分子筛层析获得次级键缔合的蛋白质请见： 确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计凌波丽个人总结之二 & 回答小雨莎莎的提问(总体思路与研究方法) http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957 |
4楼2014-12-30 00:14:16
