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nrcy1987

新虫 (初入文坛)

[求助] 提过蛋白的大牛快请进啊! 已有2人参与

蛋白大牛们,想请教一个小问题~ 我提了protein打算做EMSA,如果我提的protein是个dimer,那么在buffer里蛋白可能有monomer状态的么?多谢了!!!(我的emsa结果显示,被蛋白binding的DNA有4条带,但是DNase I footprinting显示被binding的DNA序列只可能bind一个protein dimer,所以会不会有单体状态的protein结合到了DNA上?这样的话,有dimer和monomer分别bind到DNA上,所以形成了4条带?)
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
nrcy1987: 金币+2, 有帮助 2014-12-30 10:23:24
适当的调整缓冲溶液的极性可以得到二聚体或者单体的蛋白质,而且能够用分子筛层析分离出二聚体的蛋白质。
3楼2014-12-30 00:11:01
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张解放88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
nrcy1987: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-12-30 10:29:33
我之前做蛋白的,首先先回答你的一个问题,buffer里蛋白肯定有monomer状态的,只是量多量少;第二,最为关键的您的是什么蛋白质?有的是四聚体,有的是二聚体,但是由于你在纯化或者其他手段处理的过程中,会影响蛋白质的unfolding and refolding;第三,你说的几条带可以根据DNase I footprinting显示亮度来判断。dimer bind到DNA上应该是最亮的,其他弱;第四;假阳性存在,自己猜资料解决。
2楼2014-12-29 19:28:47
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

怎么用分子筛层析获得次级键缔合的蛋白质请见:

确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计凌波丽个人总结之二 & 回答小雨莎莎的提问(总体思路与研究方法)
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957
4楼2014-12-30 00:14:16
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nrcy1987

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 张解放88 at 2014-12-29 19:28:47
我之前做蛋白的,首先先回答你的一个问题,buffer里蛋白肯定有monomer状态的,只是量多量少;第二,最为关键的您的是什么蛋白质?有的是四聚体,有的是二聚体,但是由于你在纯化或者其他手段处理的过程中,会影响蛋 ...

感谢你的回复!我这个protein是用cross-linking确定的是个dimer,是初步确定。我做的DNase I footprinting结果显示有50bp的DNA被binding,是一个整个的region。但是EMSA结果永远是很清晰的4条带。不知该如何解释。。。被binding的50bp的中间是一个反向互补序列(估计一个dimer结合在此),但在这个反向互补序列两边还分别有十几个bp也是被binding的。请问,两端的这个没有什么规律的序列是不是非特异性的结合上了蛋白(dimer或者monomer)?多谢了!!!
5楼2014-12-30 10:36:49
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