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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 提过蛋白的大牛快请进啊！
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nrcy1987

新虫 (初入文坛)

[求助] 提过蛋白的大牛快请进啊！ 已有2人参与

蛋白大牛们，想请教一个小问题~ 我提了protein打算做EMSA，如果我提的protein是个dimer，那么在buffer里蛋白可能有monomer状态的么？多谢了！！！（我的emsa结果显示，被蛋白binding的DNA有4条带，但是DNase I footprinting显示被binding的DNA序列只可能bind一个protein dimer，所以会不会有单体状态的protein结合到了DNA上？这样的话，有dimer和monomer分别bind到DNA上，所以形成了4条带？）
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1楼 2014-12-28 11:09:58
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
nrcy1987: 金币+2, ★有帮助 2014-12-30 10:23:24
适当的调整缓冲溶液的极性可以得到二聚体或者单体的蛋白质，而且能够用分子筛层析分离出二聚体的蛋白质。
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3楼2014-12-30 00:11:01
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张解放88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
nrcy1987: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-12-30 10:29:33
我之前做蛋白的，首先先回答你的一个问题，buffer里蛋白肯定有monomer状态的，只是量多量少；第二，最为关键的您的是什么蛋白质？有的是四聚体，有的是二聚体，但是由于你在纯化或者其他手段处理的过程中，会影响蛋白质的unfolding and refolding；第三，你说的几条带可以根据DNase I footprinting显示亮度来判断。dimer bind到DNA上应该是最亮的，其他弱；第四;假阳性存在，自己猜资料解决。
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2楼2014-12-29 19:28:47
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

怎么用分子筛层析获得次级键缔合的蛋白质请见：

确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计凌波丽个人总结之二 & 回答小雨莎莎的提问(总体思路与研究方法)
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957
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4楼2014-12-30 00:14:16
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nrcy1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张解放88 at 2014-12-29 19:28:47
我之前做蛋白的，首先先回答你的一个问题，buffer里蛋白肯定有monomer状态的，只是量多量少；第二，最为关键的您的是什么蛋白质？有的是四聚体，有的是二聚体，但是由于你在纯化或者其他手段处理的过程中，会影响蛋 ...

感谢你的回复！我这个protein是用cross-linking确定的是个dimer，是初步确定。我做的DNase I footprinting结果显示有50bp的DNA被binding，是一个整个的region。但是EMSA结果永远是很清晰的4条带。不知该如何解释。。。被binding的50bp的中间是一个反向互补序列（估计一个dimer结合在此），但在这个反向互补序列两边还分别有十几个bp也是被binding的。请问，两端的这个没有什么规律的序列是不是非特异性的结合上了蛋白（dimer或者monomer）？多谢了！！！
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5楼2014-12-30 10:36:49
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