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lmc2537

铜虫 (小有名气)

[求助] 转染质粒后，细胞死亡了一半，显微镜下看，一个视野只有三四个细胞转进去了， 已有2人参与

应该能排除lipo的原因，因为单独加lipo的没事，查了网上说可能leaking expression导致的，但不是很明白，求大家解答，谢谢！
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1楼 2014-12-24 10:48:02
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lmc2537

铜虫 (小有名气)
没人理我吗？摸索了两个多月了，依然徒劳！
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2楼2014-12-24 14:51:51
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lmc2537(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-12-26 20:36:29
lmc2537: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-12-29 00:30:56
质粒里也许有内毒素, 重新提下质粒或者除下内毒素
要么就细胞覆盖率稍微高一点再转染，覆盖率比较低的时候转染有时候就是死得很惨
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2014-12-25 08:34:43
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72度冰

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lmc2537(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励热心回帖交流 2014-12-26 20:36:39
lmc2537: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-12-29 00:30:48
lmc2537: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-12-29 00:31:09
这种情况有很多种原因：
1. 转染的量过大。单独转Lipo不加质粒的时候细胞是绝对不会死很多的，这点请放心。但是转染剂量过大细胞就会死亡很多，例如6孔板，我一般转2-3ug,但是如果你转了5ug，细胞就肯定会死一些。同时如果Lipo2000的量过大也会死，例如lipo2000:质粒=2:1 时，其实虽然效率高了但是毒性是很强的，工程细胞如293推荐用1:1转就绝对可以。
2. 细胞脆弱。 细胞的培养条件，细胞的种类，细胞的状态都会导致细胞的脆弱程度不一样。有一些原代细胞比较容易死亡倒的确是真的。普通的工程细胞的话基本死亡率不会很高。这就是基础了，如何养好细胞，你可以自己找找资料。
3. 转染后换液时间。过去lipo2000说明书上写着不建议带着血清转染，但是现在可能是竞争原因又改成可以血清转染了。所以如果你还是按照前人的方法（其实也是效果最好的方法）即转染前细胞换液opti-MEM, 转染后4-6h换培养基+血清的话，就要注意转染时间了，超过6h，毒性过强细胞肯定会死很多。如果是普通的293类的细胞，个人验证过，带着血清转染也是没问题的而且不用再单独换一次液，但是最好不要带抗生素。
4. lipo2000问题。 水货很多，如果你保证自己用的是正品行货，也不排除这个批次的毒性过强。（此条几率很小）
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吾非予苍生，乃为汝，魁于天下。
4楼2014-12-25 13:47:43
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72度冰

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 72度冰 at 2014-12-25 13:47:43
这种情况有很多种原因：
1. 转染的量过大。单独转Lipo不加质粒的时候细胞是绝对不会死很多的，这点请放心。但是转染剂量过大细胞就会死亡很多，例如6孔板，我一般转2-3ug,但是如果你转了5ug，细胞就肯定会死一些。 ...

还有就是楼上说的那点，细胞的密度如果过低，转染肯定也会死很多。建议80-90%再转染。
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吾非予苍生，乃为汝，魁于天下。
5楼2014-12-25 13:49:07
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lmc2537

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 72度冰 at 2014-12-25 13:47:43
这种情况有很多种原因：
1. 转染的量过大。单独转Lipo不加质粒的时候细胞是绝对不会死很多的，这点请放心。但是转染剂量过大细胞就会死亡很多，例如6孔板，我一般转2-3ug,但是如果你转了5ug，细胞就肯定会死一些。 ...

谢谢你的回答，的确是质粒过多了，我把质粒浓度降低，细胞基本就不死了，但是依然没有转进去，还有一方面是我的细胞比较脆弱吧，同样的体系，293T却好好打，转染效率有70%左右。细胞密度我一般达到80%左右转染。
准备换个载体试试了。
再次谢谢你的回答！
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6楼2014-12-29 00:35:16
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