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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我想体外大量表达某一基因以获得大量目的物质，不知道该怎么做呀～～～
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guyue900905

新虫 (初入文坛)

[求助] 我想体外大量表达某一基因以获得大量目的物质，不知道该怎么做呀～～～ 已有2人参与

我自己现在有点思路，从乳酸菌里提出DNA,进行PCR扩增，然后跑胶进行胶回收，转到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，之后该怎么做那？对阳性克隆进行培养？之后的代谢产物中怎么筛出我想要的目的物质那？
还是说我这么个思路就是不对的。求教高手指点一二，自己很糊涂，谢谢您啦！！！
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1楼 2014-12-23 21:49:40
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-07 16:47:38
代谢物质是指蛋白？
如果是蛋白，那就把阳性克隆质粒转进专做表达用的感受态里，如BL21，表达蛋白。
如果不是蛋白，就不知道啦。
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2楼2014-12-24 11:13:20
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-07 16:47:42
你的目的就是获得目的蛋白是吧，你之前的思路是对的，首先PCR获得目的基因，将其构建到原核载体中,载体可以是HIS标签的PET系列表达质粒载体或GST标签的PGEX系列表达质粒载体，筛选出阳性克隆后，将阳性质粒转入用于表达的感受态中，注意培养基中要加IPTG诱导剂诱导目的蛋白大量表达，然后就可以用相应的柱子纯化了
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guyue900905
医学&统计学
3楼2014-12-28 14:51:00
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guyue900905

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 董博士 at 2014-12-28 14:51:00
你的目的就是获得目的蛋白是吧，你之前的思路是对的，首先PCR获得目的基因，将其构建到原核载体中,载体可以是HIS标签的PET系列表达质粒载体或GST标签的PGEX系列表达质粒载体，筛选出阳性克隆后，将阳性质粒转入用于 ...

谢谢。实在是受益匪浅，我现在无法判断我的目的物质是否为蛋白质，只知道它是一种呋喃酮类化合物。这种也能按上述方法做么？并且HIS标签的PET序列表达质粒载体直接可以找试剂公司买到么？还是需要自己做？谢谢啦！
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4楼2015-01-06 09:47:57
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