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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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fairyjsj

版主

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[求助] DGGE上样量以及数据分析相关问题 已有2人参与

最近在用DGGE检测小鼠粪便的微生物种类的变化,8%的变性胶,浓度梯度在35%-55%,利用TAKARA的primeSTAR Max premix来扩增微生物的V3可变区片段,第一次跑不知道上样量多少合适就取了20ul上样,结果85V,跑了17个小时,结果如图:
现在我觉得自己存在问题有一下几点,还请各位经验满满的虫友们给点意见:
(1)上样量一直是我纠结的问题,因为跑胶后会针对条带进行分析,所以上样前是否需要对PCR产物进行浓度测定,以此保证每个孔的上样量是一致的。抑或者保证PCR时模板的含量都是一样的,扩增同样的同样的循环数后,取同样量的PCR产物上样就好了?
(2)制胶的问题,第一次跑我没有上浓缩胶,全部都是分离胶。我的板子是16X16的biorad的胶,上样时按照说明把刻度调到14.5,结果发现注射器里的胶全部推入胶板后就没有空间灌浓缩胶,我是不是哪里弄错了。
(3)关于跑胶的时间和电压及电流,我找到了好多protocol,跑胶的电压和时间都不相同,我这次用的是85V,20mA,跑了17个小时还没有跑到底,由于是第一次跑觉得肯定难看就拆了板做了银染走了一下流程。大家能否给我个比较常用的跑胶条件。
(4)分析软件,从bio-rad的官网下了quantity One,但都是basic的,琼脂糖凝胶电泳的图都无法放进去分析,有没有虫友可以介绍一下其他的比较好用的分析软件。
以上几个问题,小女子跪求各位虫友给点建议,万分感激!谢谢各位了!

DGGE上样量以及数据分析相关问题
IMG_0974.JPG
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zhongzhen

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

内容已删除
2楼2015-03-22 16:59:44
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zhongzhen

实习版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

上样量要自己摸索,我是靠经验的,跑得好看就行
跑17h没到底,可以把高浓度调低,例如35%-50%
3楼2015-03-22 17:03:06
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老脸挂不住

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

1’如果一直纠结它的话就去解决它,剩余泳道弄个梯度看看嘛,目的是跑出好看的条带,多试几次
2‘14.5那个本山就可以灌满玻璃板啦,哪会再有空间
3’我当时用的电压比较大200v,跑了5个小时左右都差不多,跑出的条带还可以,六个小时也不错,10%的胶,另外我的是30~70%,现在用的好像大多是30-60%,你具体多查查文献吧,
4‘当时用的也是quantity one觉得还不错,现在看来也有不少用其他的
我要这天,再遮不住我眼要这地,再埋不了我心要这众生,都明白我意要那诸佛,都烟消云散
4楼2015-03-22 21:47:27
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