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fairyjsj

银虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
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专业: 动物遗传学

[求助] DGGE上样量以及数据分析相关问题已有2人参与

最近在用DGGE检测小鼠粪便的微生物种类的变化，8%的变性胶，浓度梯度在35%-55%，利用TAKARA的primeSTAR Max premix来扩增微生物的V3可变区片段，第一次跑不知道上样量多少合适就取了20ul上样，结果85V，跑了17个小时，结果如图：
现在我觉得自己存在问题有一下几点，还请各位经验满满的虫友们给点意见：
（1）上样量一直是我纠结的问题，因为跑胶后会针对条带进行分析，所以上样前是否需要对PCR产物进行浓度测定，以此保证每个孔的上样量是一致的。抑或者保证PCR时模板的含量都是一样的，扩增同样的同样的循环数后，取同样量的PCR产物上样就好了？
（2）制胶的问题，第一次跑我没有上浓缩胶，全部都是分离胶。我的板子是16X16的biorad的胶，上样时按照说明把刻度调到14.5，结果发现注射器里的胶全部推入胶板后就没有空间灌浓缩胶，我是不是哪里弄错了。
（3）关于跑胶的时间和电压及电流，我找到了好多protocol，跑胶的电压和时间都不相同，我这次用的是85V，20mA，跑了17个小时还没有跑到底，由于是第一次跑觉得肯定难看就拆了板做了银染走了一下流程。大家能否给我个比较常用的跑胶条件。
（4）分析软件，从bio-rad的官网下了quantity One，但都是basic的，琼脂糖凝胶电泳的图都无法放进去分析，有没有虫友可以介绍一下其他的比较好用的分析软件。
以上几个问题，小女子跪求各位虫友给点建议，万分感激！谢谢各位了！

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老脸挂不住

铜虫 (小有名气)

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专业: 环境工程

【答案】应助回帖

1’如果一直纠结它的话就去解决它，剩余泳道弄个梯度看看嘛，目的是跑出好看的条带，多试几次
2‘14.5那个本山就可以灌满玻璃板啦，哪会再有空间
3’我当时用的电压比较大200v，跑了5个小时左右都差不多，跑出的条带还可以，六个小时也不错，10%的胶，另外我的是30~70%，现在用的好像大多是30-60%,你具体多查查文献吧，
4‘当时用的也是quantity one觉得还不错，现在看来也有不少用其他的