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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 连接体系中啥出问题了？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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lybio

金虫 (正式写手)

[交流] 连接体系中啥出问题了？

10ul连接体系：
载体   2.7ul（约50ng）先平端酶切，胶回收。后CIAP，用酚抽提，醇沉淀。
                                用灭菌，经55度预热的ddW溶解。
DNA片断    2.7ul（约100ng） 用pfu酶进行PCR（PCR产物是平端的），
                                          胶回收。与载体摩尔比约10:1

PEG8000    3.7ul（终浓度为15％）
T4连接酶 buffer   1ul
T4连接酶（宝生物）   1ul
16度反应16h，也试过用16度，22度，4度的不同温度循环反应。但就一直没连上，转化的大肠杆菌一个都没长，到底是哪出了问题？谢谢指教！

[ Last edited by lybio on 2008-5-22 at 19:47 ]
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1楼 2008-05-21 14:57:20
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humants

金虫 (正式写手)
建议取保生物的论坛上问一下，他们自己的东西因该比较了解。
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2楼2008-05-21 16:22:16
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sailor7166262

金虫 (小有名气)
平锻端连接的连接酶的用量要大于粘端连接，你的酶量太少啦，建议扩大连接体系，增加连接酶量。而且你的载体都是平端酶切是用的同样的酶吗？单切还是双切？建议作一个对照，看看是否需要去磷酸化，载体自连效率如何。

其次，检查一下你的感受态。
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3楼2008-05-21 17:43:53
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yangym1123

木虫 (小有名气)
感受态细胞没有问题吧？
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4楼2008-05-21 20:50:41
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weiwei1

木虫 (小有名气)
回收后，载体和片段测浓度了吗,还是按照之前的浓度计算的？回收后还有多少量？而且乙醇沉淀也可能把片段弄丢
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5楼2008-05-22 08:29:44
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jerome711

银虫 (小有名气)
我从你的体系里没有看见连接酶啊？？？？
DNA Ligase
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做懂得生活的人
6楼2008-05-22 09:37:33
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cdl007

木虫 (正式写手)
载体   2.7ul（约50ng）
DNA片断    2.7ul 约100ng
明显比例不对，2：1
还有你总体系太小了，怎么才10ul
扩大体系，因为这是一个概率问题，你东西多了，总有能连上的，
还有你涂板的时候多少菌液涂一个板？一般是100ul-200ul，建议你500ul涂，或者将将菌液多涂几个板，别浪费了
多做两次吧，毕竟是小概率事件，酶连温度16可以了，别的是考虑酶连出错才摸索的，你跟本没出来的话，摸那个温度没意义。
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7楼2008-05-22 12:16:50
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redsnowing575

银虫 (小有名气)
连接前还是要跑个电泳看看载体和外源的浓度再连接，一般载体要20－30ng/ul 就可以了，连接的时候只要1ul 就够了，外源多加一些，我们这里不加PEG做平端连接连得也挺好的，另外检查你的感受态是不是有问题。
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8楼2008-05-22 17:05:18
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playboy723

金虫 (正式写手)
呵呵  我知道原因  但你得给我加金币
1：你的引物5，端加P了没？  你把载体去Ｐ了    假如引物5，端没有P话根本不可能连上的
2：平端连的时候体系中要加些ATP，这样效率高些   另外比例也一定要控制好，严格按照1：3－10   否则也很难连的
你试试吧
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9楼2008-05-22 20:59:07
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lybio

金虫 (正式写手)
引物5‘端为什么要加P呢？只要载体去P，DNA片段跟它也能连接上，只是有一个缺口而已，最后还是能补平的，不是吗？
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10楼2008-05-22 21:18:52
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