应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 连接体系中啥出问题了？
101/1返回列表
查看: 884  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

lybio

金虫 (正式写手)

[交流] 连接体系中啥出问题了？

10ul连接体系：
载体   2.7ul（约50ng）先平端酶切，胶回收。后CIAP，用酚抽提，醇沉淀。
                                用灭菌，经55度预热的ddW溶解。
DNA片断    2.7ul（约100ng） 用pfu酶进行PCR（PCR产物是平端的），
                                          胶回收。与载体摩尔比约10:1

PEG8000    3.7ul（终浓度为15％）
T4连接酶 buffer   1ul
T4连接酶（宝生物）   1ul
16度反应16h，也试过用16度，22度，4度的不同温度循环反应。但就一直没连上，转化的大肠杆菌一个都没长，到底是哪出了问题？谢谢指教！

[ Last edited by lybio on 2008-5-22 at 19:47 ]
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2008-05-21 14:57:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

humants

金虫 (正式写手)
建议取保生物的论坛上问一下，他们自己的东西因该比较了解。
赞一下 回复此楼
2楼2008-05-21 16:22:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sailor7166262

金虫 (小有名气)
平锻端连接的连接酶的用量要大于粘端连接，你的酶量太少啦，建议扩大连接体系，增加连接酶量。而且你的载体都是平端酶切是用的同样的酶吗？单切还是双切？建议作一个对照，看看是否需要去磷酸化，载体自连效率如何。

其次，检查一下你的感受态。
赞一下 回复此楼
3楼2008-05-21 17:43:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangym1123

木虫 (小有名气)
感受态细胞没有问题吧？
赞一下 回复此楼
4楼2008-05-21 20:50:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weiwei1

木虫 (小有名气)
回收后，载体和片段测浓度了吗,还是按照之前的浓度计算的？回收后还有多少量？而且乙醇沉淀也可能把片段弄丢
赞一下 回复此楼
5楼2008-05-22 08:29:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jerome711

银虫 (小有名气)
我从你的体系里没有看见连接酶啊？？？？
DNA Ligase
赞一下 回复此楼
做懂得生活的人
6楼2008-05-22 09:37:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdl007

木虫 (正式写手)
载体   2.7ul（约50ng）
DNA片断    2.7ul 约100ng
明显比例不对，2：1
还有你总体系太小了，怎么才10ul
扩大体系，因为这是一个概率问题，你东西多了，总有能连上的，
还有你涂板的时候多少菌液涂一个板？一般是100ul-200ul，建议你500ul涂，或者将将菌液多涂几个板，别浪费了
多做两次吧，毕竟是小概率事件，酶连温度16可以了，别的是考虑酶连出错才摸索的，你跟本没出来的话，摸那个温度没意义。
赞一下 回复此楼
7楼2008-05-22 12:16:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

redsnowing575

银虫 (小有名气)
连接前还是要跑个电泳看看载体和外源的浓度再连接，一般载体要20－30ng/ul 就可以了，连接的时候只要1ul 就够了，外源多加一些，我们这里不加PEG做平端连接连得也挺好的，另外检查你的感受态是不是有问题。
赞一下 回复此楼
8楼2008-05-22 17:05:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

playboy723

金虫 (正式写手)
呵呵  我知道原因  但你得给我加金币
1：你的引物5，端加P了没？  你把载体去Ｐ了    假如引物5，端没有P话根本不可能连上的
2：平端连的时候体系中要加些ATP，这样效率高些   另外比例也一定要控制好，严格按照1：3－10   否则也很难连的
你试试吧
赞一下 回复此楼
9楼2008-05-22 20:59:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lybio

金虫 (正式写手)
引物5‘端为什么要加P呢？只要载体去P，DNA片段跟它也能连接上，只是有一个缺口而已，最后还是能补平的，不是吗？
赞一下 回复此楼
10楼2008-05-22 21:18:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lybio 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 uKOSCocCb6Fm 2026-11-12 6/300 2026-11-14 08:59 by dHydBGAkDh6v
[考博] 考博求助 10+3 社会实践对别 2026-11-08 3/150 2026-11-13 14:04 by 沐小虫252
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +5 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 9/450 2026-11-13 11:02 by Equinoxhua
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 cdqGD6ftHmbl 2026-11-11 5/250 2026-11-12 12:28 by ECLTXnJnRSXf
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 cdqGD6ftHmbl 2026-11-11 5/250 2026-11-12 12:28 by ECLTXnJnRSXf
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 cdqGD6ftHmbl 2026-11-11 4/200 2026-11-12 12:26 by ECLTXnJnRSXf
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 Z7qfCsdIiD1T 2026-11-10 7/350 2026-11-12 11:33 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 Z7qfCsdIiD1T 2026-11-10 4/200 2026-11-12 11:22 by HajghKOMynmz
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 G2rhSvqvhNzl 2026-11-10 7/350 2026-11-12 10:49 by HajghKOMynmz
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 czAiolzR0IJC 2026-11-10 8/400 2026-11-12 10:49 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 G2rhSvqvhNzl 2026-11-10 6/300 2026-11-12 10:36 by HajghKOMynmz
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 6/300 2026-11-12 10:27 by HajghKOMynmz
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 9/450 2026-11-12 09:21 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 cdqGD6ftHmbl 2026-11-11 3/150 2026-11-12 07:53 by HajghKOMynmz
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 Z7qfCsdIiD1T 2026-11-10 6/300 2026-11-12 07:09 by 9fOTqj074tIg
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 czAiolzR0IJC 2026-11-10 5/250 2026-11-12 06:36 by 9fOTqj074tIg
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 8/400 2026-11-12 05:08 by 9fOTqj074tIg
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 9/450 2026-11-12 04:57 by 9fOTqj074tIg
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 7/350 2026-11-12 00:44 by 9fOTqj074tIg
[考博] 申请环境，微生物方向博士 +3 浅笑09 2026-11-08 3/150 2026-11-10 12:44 by 可淡不可忘
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭