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103007054019

新虫 (小有名气)

[求助] 求助 已有9人参与

请教高人指点。我做连接转化实验时,用T1感受态细胞做载体,一个被酶切的的质粒连一个插入片段转化进入感受态细胞,质粒具有Amp抗性。同时我做了负对照,就是连接时不加插入片段,而用水代替。结果涂到Amp的板子上过夜培养后,负对照总是长菌。而且几乎和连接物转化长的一样多。怀疑质粒没有切开,又重新酶切,连接,转化,结果还是一样,负对照仍然长好多菌。请问这是什么原因,我做的实验不多,经验不丰富,请教高人指点。跪求指点
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hxxzhz

铜虫 (小有名气)

努力做一件事情。。。
2楼2014-12-07 10:51:46
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hxxzhz

铜虫 (小有名气)

其实论坛我也是新手。我是想问你什么质粒,这样我能确定你切开质粒是否有用,你是双酶切切的载体吗?
努力做一件事情。。。
3楼2014-12-07 13:15:55
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103007054019

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hxxzhz at 2014-12-07 13:15:55
其实论坛我也是新手。我是想问你什么质粒,这样我能确定你切开质粒是否有用,你是双酶切切的载体吗?

At质粒。是单酶切的,
4楼2014-12-07 14:25:04
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hxxzhz

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
103007054019(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-07 19:38:59
103007054019: 金币+1 2014-12-09 09:38:21
单酶切质粒会自连,所以对照会长一片。你试试双酶切。而且你连接片段那个板上的斑也很有可能自连了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
努力做一件事情。。。
5楼2014-12-07 14:33:11
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
103007054019(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-07 19:39:08
其实不论负对照有什么问题,你可以通过菌落PCR筛选重组质粒转化的阳性克隆,得到重组质粒就可以
慎思明辨博学笃行
6楼2014-12-07 19:00:30
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SundayMilk

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
103007054019: 金币+1 2014-12-09 09:58:50
自连多可以载体做去磷酸化啊

[ 发自小木虫客户端 ]
急速潜航~
7楼2014-12-07 19:40:06
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
103007054019: 金币+4 2014-12-09 09:32:47
单酶切的话载体会重新连接,自然就获得了AMP抗性,还是双酶切比较好
8楼2014-12-08 10:28:21
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103007054019

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hxxzhz at 2014-12-07 14:33:11
单酶切质粒会自连,所以对照会长一片。你试试双酶切。而且你连接片段那个板上的斑也很有可能自连了

酶切之后已经CIP处理过了呀!处理过也还是会自连吗?我做了好多次了,第一次是AMP100的板子,对照也像谅解产物一样,长满了板子,第二次AMP50的也是同样情况,后来又配制的AMP200,AMP100的新板子,结果一个菌都不长了,我现在真的不知道是什么原因了,很担心,
9楼2014-12-09 09:38:08
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103007054019

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by korchagin at 2014-12-08 10:28:21
单酶切的话载体会重新连接,自然就获得了AMP抗性,还是双酶切比较好

酶切之后已经CIP处理过了呀!处理过也还是会自连吗?我做了好多次了,第一次是AMP100的板子,对照也像谅解产物一样,长满了板子,第二次AMP50的也是同样情况,后来又配制的AMP200,AMP100的新板子,结果一个菌都不长了,我现在真的不知道是什么原因了,很担心,
10楼2014-12-09 09:52:57
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