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103007054019

新虫 (小有名气)

[求助] 求助 已有9人参与

请教高人指点。我做连接转化实验时，用T1感受态细胞做载体，一个被酶切的的质粒连一个插入片段转化进入感受态细胞，质粒具有Amp抗性。同时我做了负对照，就是连接时不加插入片段，而用水代替。结果涂到Amp的板子上过夜培养后，负对照总是长菌。而且几乎和连接物转化长的一样多。怀疑质粒没有切开，又重新酶切，连接，转化，结果还是一样，负对照仍然长好多菌。请问这是什么原因，我做的实验不多，经验不丰富，请教高人指点。跪求指点
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1楼 2014-12-07 09:42:41
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103007054019

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hxxzhz at 2014-12-07 14:33:11
单酶切质粒会自连，所以对照会长一片。你试试双酶切。而且你连接片段那个板上的斑也很有可能自连了

酶切之后已经CIP处理过了呀！处理过也还是会自连吗？我做了好多次了，第一次是AMP100的板子，对照也像谅解产物一样，长满了板子，第二次AMP50的也是同样情况，后来又配制的AMP200，AMP100的新板子，结果一个菌都不长了，我现在真的不知道是什么原因了，很担心，
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9楼2014-12-09 09:38:08
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hxxzhz

铜虫 (小有名气)
其实论坛我也是新手。我是想问你什么质粒，这样我能确定你切开质粒是否有用，你是双酶切切的载体吗？
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努力做一件事情。。。
3楼2014-12-07 13:15:55
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103007054019

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxxzhz at 2014-12-07 13:15:55
其实论坛我也是新手。我是想问你什么质粒，这样我能确定你切开质粒是否有用，你是双酶切切的载体吗？

At质粒。是单酶切的，
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4楼2014-12-07 14:25:04
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hxxzhz

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
103007054019(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-07 19:38:59
103007054019: 金币+1 2014-12-09 09:38:21
单酶切质粒会自连，所以对照会长一片。你试试双酶切。而且你连接片段那个板上的斑也很有可能自连了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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努力做一件事情。。。
5楼2014-12-07 14:33:11
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查看全部 18 个回答
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