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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助
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103007054019

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by guoliwang at 2014-12-07 19:00:30
其实不论负对照有什么问题，你可以通过菌落PCR筛选重组质粒转化的阳性克隆，得到重组质粒就可以

酶切之后已经CIP处理过了呀！处理过也还是会自连吗？我做了好多次了，第一次是AMP100的板子，对照也像谅解产物一样，长满了板子，第二次AMP50的也是同样情况，后来又配制的AMP200，AMP100的新板子，结果一个菌都不长了，我现在真的不知道是什么原因了，很担心，
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11楼2014-12-09 09:54:41
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
103007054019: 金币+2, ★有帮助, 谢谢 2014-12-13 11:36:17
问题根源
(1)单酶切之后自连机率高，
(2)另外还有就是单酶切的效率是否足够高？
(3)单酶切之后连接可以衍生的新问题----插入片段可能正向也可能反向!!!

建议
(1)改用双酶切
(2)调整酶切质粒和插入片段的比例，能降低点载体自连的机率
(3)事倍功半的方法---多挑克隆，鉴定，总有挑出所需克隆的一天，哈哈
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12楼2014-12-09 15:43:25
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yuheny

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
负对照长菌可能是板子的抗性失效了，一般来说你只要能从你要的板子上挑到阳性克隆就好
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13楼2014-12-09 16:59:23
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smilentless

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
9楼: Originally posted by 103007054019 at 2014-12-09 09:38:08
酶切之后已经CIP处理过了呀！处理过也还是会自连吗？我做了好多次了，第一次是AMP100的板子，对照也像谅解产物一样，长满了板子，第二次AMP50的也是同样情况，后来又配制的AMP200，AMP100的新板子，结果一个菌都不 ...

单酶切完不得跑胶切胶，提取DNA后，就没有CIP了，所以自链很正常。建议还是双酶切，双酶切完跑胶切下来的断口不能自链。
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14楼2014-12-09 17:47:51
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103007054019

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by guoliwang at 2014-12-07 19:00:30
其实不论负对照有什么问题，你可以通过菌落PCR筛选重组质粒转化的阳性克隆，得到重组质粒就可以

请问菌落PCR 筛选重组质粒怎么做啊？我又重新酶切，转化涂板子，结果负对照又长了。。。。
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15楼2014-12-13 10:25:23
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路飞的小猪

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
16楼2014-12-13 10:27:38
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弑者星魂

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我们一般不做负对照，你的目的是得到连接后的质粒，从里面筛选就可以了。如果正负长的差不多的话，应该选不大出来。我们用的都是双酶切，成功率还是挺大的。

[ 发自小木虫客户端 ]
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17楼2014-12-13 10:40:44
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103007054019

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 弑者星魂 at 2014-12-13 10:40:44
我们一般不做负对照，你的目的是得到连接后的质粒，从里面筛选就可以了。如果正负长的差不多的话，应该选不大出来。我们用的都是双酶切，成功率还是挺大的。

哦哦，好的，谢谢！
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18楼2014-12-14 20:14:05
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