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103007054019

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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在线: 10.2小时
虫号: 1393939
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专业: 植物生理与生化

[求助] 求助已有9人参与

请教高人指点。我做连接转化实验时，用T1感受态细胞做载体，一个被酶切的的质粒连一个插入片段转化进入感受态细胞，质粒具有Amp抗性。同时我做了负对照，就是连接时不加插入片段，而用水代替。结果涂到Amp的板子上过夜培养后，负对照总是长菌。而且几乎和连接物转化长的一样多。怀疑质粒没有切开，又重新酶切，连接，转化，结果还是一样，负对照仍然长好多菌。请问这是什么原因，我做的实验不多，经验不丰富，请教高人指点。跪求指点

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1楼 2014-12-07 09:42:41

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

smilentless

铜虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 249.5
帖子: 34
在线: 36小时
虫号: 2816145
注册: 2013-11-20

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

引用回帖:

9楼: Originally posted by 103007054019 at 2014-12-09 09:38:08
酶切之后已经CIP处理过了呀！处理过也还是会自连吗？我做了好多次了，第一次是AMP100的板子，对照也像谅解产物一样，长满了板子，第二次AMP50的也是同样情况，后来又配制的AMP200，AMP100的新板子，结果一个菌都不 ...

单酶切完不得跑胶切胶，提取DNA后，就没有CIP了，所以自链很正常。建议还是双酶切，双酶切完跑胶切下来的断口不能自链。