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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 求助求组，纯菌和PCR方面的问题，希望大家进来帮我分析分析，万分感谢
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wlh太阳花

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助求组，纯菌和PCR方面的问题，希望大家进来帮我分析分析，万分感谢 已有3人参与

我养的是细菌，涂板是单菌落，PCR用的引物是27f、1492r，PCR照胶只有目的条带，一点杂带也没有，可是PCR产物测序回来，1492r测序成功，27f测序结果是杂合，我送了几个样，几乎都是这样，这是什么原因，我想知道，涂板是单菌落能证明我的菌是纯菌吗？  我挑单菌落  菌不长，所以我每次都只能用菌保里的菌养。我也不知道我这个菌挑菌为什么不长。。。小女子真是一点办法都没有啦，麻烦各位亲 帮帮我吧
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1楼 2014-11-30 17:16:40
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
多划几次单克隆，直到得到单菌落。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-11-30 19:20:58
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wlh太阳花

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-11-30 19:20:58
多划几次单克隆，直到得到单菌落。

涂板一直是单菌落  划线也是单菌落
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3楼2014-11-30 20:59:14
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by wlh太阳花 at 2014-11-30 20:59:14
涂板一直是单菌落  划线也是单菌落...

在单菌落的基础上多次划单菌落，优化pcr体系。一般细菌只有一个16s，不太会出现这种情况。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-11-30 21:14:10
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jingquan

铜虫 (正式写手)
你仔细看涂片电镜，有时候，个别视野看着是单个菌，但是整个片子是否也是。确定是纯菌了。PCR产物最好回收后连接载体送去测序。这样用通用引物从载体开始测，直接产物开始的碱基峰会很乱的。
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5楼2014-12-02 12:11:25
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lnf117

铁杆木虫 (正式写手)
用的聚合酶换挟

[ 发自小木虫客户端 ]
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恶心自己，服务别人
6楼2014-12-02 21:47:27
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dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看菌落是否纯有这几种办法：形态学上观察，镜检，测序是其中一种，你说27F测序有问题，1492R没问题，那可能是公司的问题。
当然16S这个在有些类群中是有两种的
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7楼2014-12-03 08:49:52
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开小猫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主你是送的PCR产物么？我们都是转到DH5α，然后送克隆子，那样会比较准。我也送过PCR产物，经常测不出来。
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8楼2014-12-05 14:16:39
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