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金虫 (初入文坛)

[交流] 定点突变测序结果居然没有突变上,什么原因 已有5人参与

我正在做定点突变,利用导师设计好的定点突变引物扩增后,dpn1酶解去除未点突变的模板,然后进行T载体连接转化(有设对照,对照未长),送去测序后,居然没有测到点突变,这是什么原因呢?
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1360548549

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by xuzhu598 at 2014-11-26 23:42:01
引物没有问题的话应该就是模板的问题,建议模板少加一点!模板消化后不是直接纯化做transformation吗,怎么还要连到T载上!

对,模板消化后,我是直接转化的,但我们导师说mbp载体用于测序太长,让再以之前突变好的模板上扩增目的片段,连到T载体测序。不知道这个环节是不是有问题,另外测序的可信度高吗
11楼2014-12-11 20:35:49
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yingxiaoying

新虫 (初入文坛)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-24 12:33:43
换扩增酶试试 高保真的可能在pcr时就自动修复了
2楼2014-11-24 09:49:22
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
定点突变用t载体?
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2014-11-26 05:20:55
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xiaoyugutou

捐助贵宾 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
if your mutant is on primer, I guess its the problem of primer
4楼2014-11-26 05:58:43
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