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抛砖引玉:关于引物设计中自由能的问题 已有1人参与
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首先关于我个人，我没有做过多少实验，主要是进行理论研究。如果有什么不对的地方，请指正，互相学习。 关于引物设计，网上有各种理论，许多理论甚至是冲突的。我很怀疑这些理论的出处，是否经过了实践的检验。 我也咨询过许多设计过引物的科研人员，对此，我感觉他们也都没有一个定性。所以我特别迷茫。 关于3'端的稳定性的问题，我说一下我的理解。 稳定性是一个俗语，科学的说法应该是在一定温度下的自由能。 gc含量、tm值和自由能的绝对值是成正比关系的。 DNA双链结合过程基本上是一个释放能量的过程，而变性过程(解开双链)则是一个吸收能量的过程。 这就意味着，结合越稳定，那破坏它就需要更多的能量，而能量只能来自于温度。 在3'端稳定性大于5'端稳定性的情况下 从变性温度94到引物退火温度(假定为55度)的过程中，引物会与模板自动结合，当稳定到55度时，已经有一半以上的引物结合在了模板上(3'端结合，5'端处于游离状态)。当温度再次升高到72度时，因为温度的升高并不足以破坏3'端与模板的结合，所以在Taq酶和镁离子的作用下，引物的3'端会与dNTP结合，实现延伸。 这就意味着，如果3'端稳定性极差，非常有可能在温度达到72度时，引物从模板上脱落，造成延伸失败。 换一种情况，如果3'端有错配，则温度在55度时，引物极有可能错配。 当温度升高到72度时，温度所提供的能量不足以破坏3'端的错配，那就会出现非特异性扩增。这可不是我们所想要的。 在5'端稳定性大于3'端稳定性的情况下 我个人认为，当温度稳定在55度时，是5'端结合在了模板上，3'端处于游离状态，事实是否这样，我不知道。 假定我的认为是正确的，那当温度72度时，3'端已经有一大部分结合在了模板上。同上，可以实现延伸。 在这种情况下，3'端的自由能越大，在72度时，3'端与模板结合的越多。相反，3'端自由能越小，那结合的越少，小到一定程序，有可能就根本无法延伸。 在实现情况下，引物100%的有错配，所以，由此可知，引物的3'端的自由能，不要太高，但也不要太低。 给出一个参考值: 9 > abs(dG) > 4。5 |
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