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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 750bp片段克隆
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劳龙宝

新虫 (小有名气)

[求助] 750bp片段克隆 已有8人参与

虫友们大家好！
       我就不卖关子了。我最近一直在做PCR，目的片段大约是750bp，体系如下：buffer~2ul，dNTPmix~1.6ul ,引物各0.5ul ，模板（cDNA）~2ul，酶~0.2ul，水~13.2ul,一起是20ul的体系，  酶是takara 的ExTaq,   程序：94  5min, 94  30s, annealing 30s,  72  45s,  35个cycles,  72  5min。  刚开始就按引物合成单上面的退火温度来做，结果只有100bp的引物二聚体，后来做了个温度梯度，结果还只有100bp的引物二聚体。上游引物是参考文献上面的，下游引物是软件设计的，上游引物18bp,下游引物19bp。求高手指导啊！先在此谢过大家了！本人金币不过，忘见谅！
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1楼 2014-11-18 17:32:57
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劳龙宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by happydove at 2014-11-19 17:30:31
1是用内参做个对照
2是用普通的酶就可以
3是如果是表达量比较低 模板量多加  先不稀释试一下
4退火温度50度先扩一下看看吧

在扩基因前我就做了内参的PCR，都有！
普通酶会不会有碱基错配啊？
今天下午做了个温度梯度，，我换了模板，估计很有可能是模板的问题，目的条带出现了，但是不亮，引物二聚体还是有！
谢谢你！祝笑口常开！
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22楼2014-11-19 19:09:40
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-18 22:50:50
你退火温度都用了多少温度的范围？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-11-18 18:11:54
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-18 22:50:58
如果改变退火温度和其它条件都无效，也许需要换引物。不过觉得你循环数有点多，25到28应该就够了，循环数再多，产物也增加不了太多。模板一般加50ng（0.5ul左右）就不少了，你质粒什么浓度？你可以把模板质粒跑电泳估测浓度，Abs260对过高和过低浓度不准。引物是10uM的吧？别和100uM搞混。还有如果只是一个反应的话，可以把反应体系增加到50ul，否则蒸发一点，再挂壁一点，对反应体系影响大，而且体积太小不好加样，另外产物量也增加了。为获得更多PCR产物，我的经验是增加反应体积比过高提高循环数好。
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慎思明辨博学笃行
3楼2014-11-18 18:40:27
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劳龙宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-11-18 18:11:54
你退火温度都用了多少温度的范围？

合成的引物上面给出的温度一个是52.3°，一个是53.3°，我做的温度梯度是50~56°
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4楼2014-11-18 18:41:34
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