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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 我想做Fe3+的金属螯合层析，请问怎么做呢?
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xissy

铜虫 (小有名气)

[求助] 我想做Fe3+的金属螯合层析，请问怎么做呢? 已有1人参与

我想表达一个蛋白，这个蛋白可以结合Fe3+，所以不用Ni-金属螯合层析，而改用Fe3+，请问这个怎么做呢？是否只要保证在合适的pH下，让Fe3+充分与柱材料结合就可以了呢？我准备用FeCl3.
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1楼 2014-11-07 15:39:30
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励交流！ 2014-11-07 22:17:03
xissy: 金币+5, ★★★很有帮助, 我已经做了Fe(III)的金属螯合了，结果是1.Fe(III)不仅可以和咪唑竞争性结合目的蛋白(可以用咪唑除杂，洗脱)；Fe(III)自身也可以结合目的蛋白(这个蛋白可以与Fe(III)结合)，因此最后用500mM的咪唑洗脱完后，再用EDTA也可以洗下近乎一般的目的蛋白。但是现在有个问题，用EDTA洗脱的目的蛋白因为含有Fe(III)而有黄色。我想如果可以去除Fe(III)就好了。不知道您有什么好建议。 2014-11-18 21:18:54
说个我的理解，以下几个问题
（1）Fe3+结合在蛋白的什么地方，是在蛋白里面，还是外面
（2）Ni(II)柱结合组氨酸的N，但是Fe3+更倾向O，S
（3）6XHistag螯合Ni（II），可逆结合洗脱的原因是，Ni柱子基质螯合Ni是不饱和的，正是没有饱和的部分才可以螯合6XHis里N，然后不同浓度的咪唑，可以竞争性的把目的蛋白洗下来

限于本人的理解，目前金属螯合柱，金属可选的有Ni（II）， Co（II）， Cu（II）， Zn（II），很容易发现都是第一排的过渡态金属，而且是二价的，而且没有Fe（II）（因为它很容易氧化成Fe（III））。
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2014-11-07 21:53:16
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xissy: 金币+5, ★★★很有帮助, 原子分析，好复杂的样子。我们做不了。还是非常感谢！ 2014-11-20 14:41:31
答案 透析，但是可能不管用
（1）把该蛋白做原子分析，看Fe（III）的含量
（2）装入透析袋
（3）用10mM EDTA + 缓冲液 透析该蛋白 3-5次换液，除去Fe(III)
（4）用缓冲液透析该蛋白，除去 EDTA (此步可以用分子筛)

如果你蛋白结合Fe（III）非常牢固，可能去不掉，不过可能性不大，good luck!
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行至水穷处，坐看云起时
3楼2014-11-19 20:19:09
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xissy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pennchem at 2014-11-19 20:19:09
答案 透析，但是可能不管用
（1）把该蛋白做原子分析，看Fe（III）的含量
（2）装入透析袋
（3）用10mM EDTA + 缓冲液 透析该蛋白 3-5次换液，除去Fe(III)
（4）用缓冲液透析该蛋白，除去 EDTA (此步可以用分子 ...

再请问一下你啊，我现在想做Zn(II)的螯合层析，因为Fe(III)会和目的蛋白结合，还是不太适用。Ni(II)又会使我的蛋白沉淀，所以想试试Zn(II)。可是在做柱子的时候遇到了难题，Zn(II)会沉淀，我试了文献推荐的50mM NaAC,500mM NaCl,pH7.0，可是Zn(II)还是沉淀了。请问您做过没有，知道怎么解决吗？

PS:我用的是ZnCl2
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4楼2014-11-20 16:20:48
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
Zn（II）沉淀，是Zn（II）溶液沉淀，还是引起目的蛋白沉淀？如果前者，降低pH值（比如6.8，或者6.5），或者降低Zn（II）浓度即可，如果是Zn（II）引起蛋白沉淀，那么是不是Fe（III）才是稳定蛋白结构的，其他金属离子不是，方便告诉你的蛋白是什么吗？
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行至水穷处，坐看云起时
5楼2014-11-21 20:25:54
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