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王丹523

铁虫 (小有名气)

[求助] 打算做qpcr 遇到一些问题 希望大家看一看 已有3人参与

我有五个基因，如果我用一个模板这样去做qpcr。我不太懂溶解曲线和扩增曲线的原理。
所以我是每次做一个基因，跑一次能同时得到溶解曲线和扩增曲线？还是能够五个基因一起跑。
我不知道溶解曲线和扩增曲线是分别跑出来的还是一次跑出来的。
机子是abi7500。用的syber green takara的。
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1楼 2014-11-05 12:00:00
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
王丹523(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-05 14:23:56
ABI7500，有多个通道，所以可以同时测几个基因，但是最好一个基因一个基因的测，因为溶解曲线是只有一条。
你选择melting curve那个才能做出熔解曲线，更多的话请参考说明书吧。
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2楼2014-11-05 13:14:59
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wxk19960113

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-11-05 13:14:59
ABI7500，有多个通道，所以可以同时测几个基因，但是最好一个基因一个基因的测，因为溶解曲线是只有一条。
你选择melting curve那个才能做出熔解曲线，更多的话请参考说明书吧。

可以五个基因一起跑，因为有不同颜色作标记，扩增曲线和溶解曲线是分别跑的。
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3楼2014-11-05 13:40:33
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王丹523

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wxk19960113 at 2014-11-05 13:40:33
可以五个基因一起跑，因为有不同颜色作标记，扩增曲线和溶解曲线是分别跑的。...

所以说  我先relative qualification 一次跑五个基因，加一个actin， 然后再跑melt curve 一次跑五个基因， 加一个actin，  数据导出分析？是这样吗？
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4楼2014-11-05 14:16:41
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王丹523

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-11-05 13:14:59
ABI7500，有多个通道，所以可以同时测几个基因，但是最好一个基因一个基因的测，因为溶解曲线是只有一条。
你选择melting curve那个才能做出熔解曲线，更多的话请参考说明书吧。

我有说明说 ，  abi  厚厚的一本 ，上面只是说了程序的设定
我想知道一次可以跑几个melt curve， 还是每次跑一个基因做溶解曲线和扩增曲线
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5楼2014-11-05 14:19:04
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
王丹523(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-08 20:02:46
引用回帖:
5楼: Originally posted by 王丹523 at 2014-11-05 14:19:04
我有说明说 ，  abi  厚厚的一本 ，上面只是说了程序的设定
我想知道一次可以跑几个melt curve， 还是每次跑一个基因做溶解曲线和扩增曲线...

我说的是一个孔的情况。
因为你用的是syber green，而它的原理是只要有DNA复制就算一个扩增，所以是分不出来5个的。。如果要同时测5个基因就需要用不同探针，根据不同通道来查看。
而熔解曲线是专门为syber green做的，因为没有探针那么准确定量，所以要查看熔解曲线以便分辨所得的是否为我们需要的产物。
因此不需要换探针，只需要分开5个孔分别测5个基因，上机测熔解曲线就OK了
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6楼2014-11-05 14:33:13
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王丹523

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-11-05 14:33:13
我说的是一个孔的情况。
因为你用的是syber green，而它的原理是只要有DNA复制就算一个扩增，所以是分不出来5个的。。如果要同时测5个基因就需要用不同探针，根据不同通道来查看。
而熔解曲线是专门为syber gree ...

我们用的是sybr green 。 熔解曲线不是要浓度梯度吗？如果我设2倍稀释，5个梯度，3个重复，这样可以吗？一个96孔板我可以把6个基因的熔解曲线全部跑完（actin也要做熔解曲线的吧）
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7楼2014-11-05 15:11:17
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
王丹523(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-08 20:03:00
引用回帖:
7楼: Originally posted by 王丹523 at 2014-11-05 15:11:17
我们用的是sybr green 。 熔解曲线不是要浓度梯度吗？如果我设2倍稀释，5个梯度，3个重复，这样可以吗？一个96孔板我可以把6个基因的熔解曲线全部跑完（actin也要做熔解曲线的吧）...

不是熔解曲线要浓度梯度，而是作标准曲线要浓度梯度。
5对基因，5对引物。
每一个基因做3个重复，5个梯度，共15孔。5个基因要75孔，96孔够了。
你排好板，先做个表格哪个孔加了什么，然后再加不会出错。
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8楼2014-11-05 15:24:56
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 王丹523 at 2014-11-05 15:11:17
我们用的是sybr green 。 熔解曲线不是要浓度梯度吗？如果我设2倍稀释，5个梯度，3个重复，这样可以吗？一个96孔板我可以把6个基因的熔解曲线全部跑完（actin也要做熔解曲线的吧）...

再插一句，做标准曲线要先做一次单孔定量PCR，不然你怎么知道要稀释多少倍才是正确的？重做还浪费试剂。
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9楼2014-11-05 15:30:06
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王丹523

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-11-05 15:30:06
再插一句，做标准曲线要先做一次单孔定量PCR，不然你怎么知道要稀释多少倍才是正确的？重做还浪费试剂。...

我连标准曲线，熔解曲线都分不清了，有没有什么参考资料，能给我看看啊，网上全部是一些看过的原理，再详细一点的就搜不到了
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10楼2014-11-05 15:56:19
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