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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 打算做qpcr 遇到一些问题 希望大家看一看
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王丹523

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-11-05 13:14:59
ABI7500，有多个通道，所以可以同时测几个基因，但是最好一个基因一个基因的测，因为溶解曲线是只有一条。
你选择melting curve那个才能做出熔解曲线，更多的话请参考说明书吧。

我今天看了一下，qpcr的程序设定是跑完扩增曲线直接跑熔解曲线的，标准曲线的话就是另跑了，在之前跑，确定引物扩增效率，熔解曲线可以看到引物的特异性
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11楼2014-11-08 16:33:04
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王丹523

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wxk19960113 at 2014-11-05 13:40:33
可以五个基因一起跑，因为有不同颜色作标记，扩增曲线和溶解曲线是分别跑的。...

是一起跑的吗？因为在跑qpcr跑完的时候，扩增曲线和熔解曲线都出来了，估计我们的程序设定是这样的
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12楼2014-11-08 16:34:08
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王丹523

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bbqlhb at 2014-11-05 15:24:56
不是熔解曲线要浓度梯度，而是作标准曲线要浓度梯度。
5对基因，5对引物。
每一个基因做3个重复，5个梯度，共15孔。5个基因要75孔，96孔够了。
你排好板，先做个表格哪个孔加了什么，然后再加不会出错。...

我现在有几个问题想问一下，如果我跑3个基因在2种样品中的表达，因为设定程序的时候会要求选择内参基因和template，我的内参基因是actin，但是我的标准template是选哪个组织呢？为什么要选这个选项呢？还是随便选择？我的actin在两个组织里面差的还挺多
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13楼2014-11-08 16:36:46
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disuta

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

设置不同浓度梯度做标准曲线是为了检测引物的扩增效率，看看适不适合做定量，相关系数一般要求达到0.99，扩增效率在90%~110%之间可以用2-△△的方法计算相对表达量，扩增效率超出这个范围就得用矫正的方法计算了。不过看到现在发表的很多文章，对做标准曲线没要求。
另外，只要能放得下，多少对引物都可以一起做
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14楼2015-05-27 15:49:38
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WHABnew

新虫 (小有名气)
五个基因一起跑ok的，只要你的孔够
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15楼2015-05-27 16:42:40
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hongyuan111

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王丹523 at 2014-11-05 14:16:41
所以说  我先relative qualification 一次跑五个基因，加一个actin， 然后再跑melt curve 一次跑五个基因， 加一个actin，  数据导出分析？是这样吗？...

不是，同时仪器会做出来

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16楼2018-03-10 14:02:59
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