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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 询问PCR退火温度设计
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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8mile

木虫 (正式写手)

[交流] 询问PCR退火温度设计

引物单上数据如下

上游TTACAAGATGGAGCCTCACC（GC含量50%）
Tm（1M Na+）：68.2
Tm（50mM Na+）：46.6

下游CAAAGAATAACCCAGGACGA（GC含量45%）
Tm（1M Na+）：66.2
Tm（50mM Na+）：44.6

退火温度应设多少？马上毕业论文答辩了，实验还没做完，急~

顺便问下大家，Tm（1M Na+）和Tm（50mM Na+）有什么区别啊？
[search]PCR退火温度[/search]

[ Last edited by 8mile on 2008-5-6 at 10:24 ]
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1楼 2008-05-05 23:41:36
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随风而过

银虫 (小有名气)
你用65度试试！
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2楼2008-05-06 08:54:18
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):比较详细，值得鼓励。
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度(C. W. 迪芬巴赫 et al., 1995)：
　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
     在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
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3楼2008-05-06 09:39:48
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辛雨237

铁杆木虫 (著名写手)
62度吧
我一般是降低5度开始摸条件
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春暖花开
4楼2008-05-06 09:57:49
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8mile

木虫 (正式写手)
60+的温度也太高了吧？
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5楼2008-05-06 10:24:51
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8mile

木虫 (正式写手)
我用44度做，有时候有带，但特异性很差。怎么办？
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6楼2008-05-06 10:25:31
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8mile

木虫 (正式写手)
顺便问下大家，Tm（1M Na+）和Tm（50mM Na+）有什么区别啊？
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7楼2008-05-06 10:25:48
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随风而过

银虫 (小有名气)
离子环境不一样呗，直接表现就是退火温度不一样！你用的温度太低了，提高温度特异性会增加。
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8楼2008-05-06 16:49:48
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qianyuyan

铜虫 (小有名气)
你可以56度试试 我一般比Tm值高个十度吧
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9楼2008-05-06 19:27:54
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qianyuyan

铜虫 (小有名气)
你可以56度试试 我一般比Tm值高个十度吧
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10楼2008-05-06 19:28:23
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