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8mile木虫 (正式写手)
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[交流]
询问PCR退火温度设计
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引物单上数据如下 上游TTACAAGATGGAGCCTCACC（GC含量50%） Tm（1M Na+）：68.2 Tm（50mM Na+）：46.6 下游CAAAGAATAACCCAGGACGA（GC含量45%） Tm（1M Na+）：66.2 Tm（50mM Na+）：44.6 退火温度应设多少？马上毕业论文答辩了，实验还没做完，急~ 顺便问下大家，Tm（1M Na+）和Tm（50mM Na+）有什么区别啊？ [search]PCR退火温度[/search] [ Last edited by 8mile on 2008-5-6 at 10:24 ] |
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2楼2008-05-06 08:54:18
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退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度(C. W. 迪芬巴赫 et al., 1995)： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 |
3楼2008-05-06 09:39:48
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4楼2008-05-06 09:57:49
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