应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » T-RFLP中回收及酶切相关问题
52/1返回列表
查看: 3098  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

张永婧1991

新虫 (初入文坛)

[求助] T-RFLP中回收及酶切相关问题 已有4人参与

我做的是肠道微生物多态性，用T-RFLP技术，已经提取出基因组总DNA，PCR体系为25ul,用通用引物扩增出目的片段，1500bp左右，条带较亮且单一，无引物二聚体等其他杂物，然后用2%的琼脂糖凝胶跑电泳做切胶回收，用的是Axygen的凝胶回收试剂盒，每次每孔回收上样量为10ul，然后将3个孔的条带切胶回收，回收后的DNA浓度却只有10ng/ul左右，用过天根的试剂盒也是基本上差不多。然后看到论坛上有人说单一条带可以不同切胶回收直接就酶切就可以，于是按照酶切体系进行酶切，PCR产物用5ul,酶用1ul。结果还是没有条带，正常情况如果不酶切的话，那条目的条带应该是存在的吧，但是酶切之后没有，说明是切开了？可是什么小条带都看不见。。还有就是如果直接PCR产物酶切的话，这个产物还要做什么预处理吗？求求各位大神，这些都快做了一个月了，还是没有结果。。。快哭了呀！以前没接触过分子，望大神指导！图1是回收后做酶切的条带，就是这种情况。

T-RFLP中回收及酶切相关问题
图1.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2014-10-25 16:28:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张永婧1991

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by j2 at 2014-10-28 21:28:22
不用loading buffer能跑出东西来？

能的，65度再失活30min就可以了，试剂公司说是可以的！
赞一下 回复此楼
11楼2014-11-06 10:38:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

peterrjp

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张永婧1991(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-26 20:46:51
实在不行可以试试PCR过柱纯化试剂盒，不过用过柱纯化会在0~50bp之间有个很高的杂峰，使用数据时就别用小于50bp的峰了。
PCR产物需要纯化后才能做酶切。
我上学时还是经常做这个的。
赞一下 回复此楼
2楼2014-10-25 20:07:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张永婧1991

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by peterrjp at 2014-10-25 20:07:26
实在不行可以试试PCR过柱纯化试剂盒，不过用过柱纯化会在0~50bp之间有个很高的杂峰，使用数据时就别用小于50bp的峰了。
PCR产物需要纯化后才能做酶切。
我上学时还是经常做这个的。

纯化应该比切胶回收好很多吧？现在情况就是切胶收不回来，不切直接酶切还是没条带。。
赞一下 回复此楼
3楼2014-10-26 10:38:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

peterrjp

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 张永婧1991 at 2014-10-26 10:38:43
纯化应该比切胶回收好很多吧？现在情况就是切胶收不回来，不切直接酶切还是没条带。。...

切胶回收效率低，过柱纯化也还凑合能用，总比你不纯化来得好。不纯化，杂质会影响酶切
赞一下 回复此楼
4楼2014-10-26 10:48:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 课题组会帮你通过考核么？ +3 好运来～9527 2026-10-10 6/300 2026-10-12 14:55 by 简单化xn
[有机交流] OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？ +4 wangyl_123 2026-10-10 7/350 2026-10-12 14:47 by chuans0923
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:34 by XQNyDCa1Tk5n
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:15 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 22:11 by XQNyDCa1Tk5n
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 14:25 by VOMexwnDzOFZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 (EPI+-1)(金币-50) +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 14:05 by VOMexwnDzOFZ
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:51 by VOMexwnDzOFZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:45 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:54 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:34 by VOMexwnDzOFZ
[考博] 招收博士生一名 +3 mandolin 2026-10-10 3/150 2026-10-11 10:21 by 不是山谷！
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 4/200 2026-10-11 03:14 by M0zrYVSAnxpE
[有机交流] 各位大佬，路线设计求助 +6 zapen 2026-10-08 8/400 2026-10-10 15:59 by zapen
[基金申请] 入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍 +5 13108017953 2026-10-08 5/250 2026-10-10 11:15 by wdwd123
[有机交流] 我应该选哪条合成路线让实验成功率高一些？ +5 jing816y 2026-10-08 9/450 2026-10-10 09:05 by zapen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭