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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 火急求助！为何Southern杂交整条DNA带都有杂交信号。
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wangweimin

铜虫 (小有名气)

[交流] 火急求助！为何Southern杂交整条DNA带都有杂交信号。

做RFLP，用Southern杂交找DNA酶切片段与探针的杂交差异带。
  探针用的是地高辛标记法，探针长度400多bp.化学法NBT/BCIP显色，Roche的试剂盒。

做了两次，每次都是只要尼龙膜上结合有DNA的部分，整条DNA带都有杂交信号，颜色很深，完全看不出杂交带型。膜上的每条泳道看起来都是一长条深色的粗线。
最诧异的是最近一次，连旁边的DNA marker都显出来了，我的探针里应该没有marker的互补片段阿
  有没有高人知道到底是哪里出了问题啊，我的杂交温度45度，会不会是杂交温度太低导致非特异性杂交阿，以前做出过一次，杂交温度也比较低，所以就没用太高温度。辛辛苦苦做了好久，毫无结果，而且面临毕业，欲哭无泪阿，有了解的帮我出出主意阿，先谢谢了！！~
[search]RFLP Souther 地高辛[/search]
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1楼 2008-05-05 20:25:17
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wangweimin

铜虫 (小有名气)
谢谢大家的回复也 很感谢版主的帮忙！
  我封闭用的是试剂盒里提供的试剂，用时用马来酸稀释下就可以了，封闭应该是封闭膜上没有结合DNA的位点吧，没DNA的位置都很干净的。
  我跑完胶后都用EB染色观察过了，电泳和转膜过程应该都没有问题的，DNA应该是都转移到膜上了，只是没有和探针的特异性杂交带。想下次在杂交的环节作些改进。
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9楼2008-05-08 09:30:43
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wangweimin

铜虫 (小有名气)
都没人知道吗，自己顶一下
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2楼2008-05-06 16:07:30
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
★
lixiaoyi1981(金币+1,VIP+0):一个值得怀疑的地方，呵呵。
是不是点样时样品跑了。
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细推物理须行乐。
3楼2008-05-06 16:29:47
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wangweimin

铜虫 (小有名气)
应该不会的，有DNA 的部分都显色了，怀疑是不是探针加多了，而且杂交不特异
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4楼2008-05-07 09:27:17
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