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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 火急求助！为何Southern杂交整条DNA带都有杂交信号。
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wangweimin

铜虫 (小有名气)

[交流] 火急求助！为何Southern杂交整条DNA带都有杂交信号。

做RFLP，用Southern杂交找DNA酶切片段与探针的杂交差异带。
  探针用的是地高辛标记法，探针长度400多bp.化学法NBT/BCIP显色，Roche的试剂盒。

做了两次，每次都是只要尼龙膜上结合有DNA的部分，整条DNA带都有杂交信号，颜色很深，完全看不出杂交带型。膜上的每条泳道看起来都是一长条深色的粗线。
最诧异的是最近一次，连旁边的DNA marker都显出来了，我的探针里应该没有marker的互补片段阿
  有没有高人知道到底是哪里出了问题啊，我的杂交温度45度，会不会是杂交温度太低导致非特异性杂交阿，以前做出过一次，杂交温度也比较低，所以就没用太高温度。辛辛苦苦做了好久，毫无结果，而且面临毕业，欲哭无泪阿，有了解的帮我出出主意阿，先谢谢了！！~
[search]RFLP Souther 地高辛[/search]
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1楼 2008-05-05 20:25:17
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wangweimin

铜虫 (小有名气)
都没人知道吗，自己顶一下
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2楼2008-05-06 16:07:30
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
★
lixiaoyi1981(金币+1,VIP+0):一个值得怀疑的地方，呵呵。
是不是点样时样品跑了。
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细推物理须行乐。
3楼2008-05-06 16:29:47
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wangweimin

铜虫 (小有名气)
应该不会的，有DNA 的部分都显色了，怀疑是不是探针加多了，而且杂交不特异
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4楼2008-05-07 09:27:17
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jie2005

银虫 (小有名气)
★
lixiaoyi1981(金币+1,VIP+0):这个可能性大些，谢谢。
没有封闭好，杂交液和blocking buffer换新的。
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5楼2008-05-07 19:14:52
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wangweimin

铜虫 (小有名气)
谢谢，不过杂交液和blocking bf ,我每次用的都是新的阿，而且膜上没有DNA的部分都非常干净，还是怀疑杂交时有问题，有几回在做一次试下
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6楼2008-05-07 22:44:38
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juliahq

铜虫 (小有名气)
★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):比较详细的分析并有解决方法。谢谢
可能是DNA电泳的问题吧，按道理讲酶切彻底，电泳的时候电压稳定（最好是20v电泳时间久些比较好），DNA分带都很均匀的，不知道你电泳结束后EB染色有没有照片看到DNA比较好的分散，DIG标记Southen的时候MARK是有带得的，再者洗膜也有问题
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7楼2008-05-07 22:59:40
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seahow

木虫 (著名写手)
肯定 是封闭不够！！你用什么封闭的。
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8楼2008-05-08 07:43:43
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wangweimin

铜虫 (小有名气)
谢谢大家的回复也 很感谢版主的帮忙！
  我封闭用的是试剂盒里提供的试剂，用时用马来酸稀释下就可以了，封闭应该是封闭膜上没有结合DNA的位点吧，没DNA的位置都很干净的。
  我跑完胶后都用EB染色观察过了，电泳和转膜过程应该都没有问题的，DNA应该是都转移到膜上了，只是没有和探针的特异性杂交带。想下次在杂交的环节作些改进。
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9楼2008-05-08 09:30:43
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stonehhy

木虫 (正式写手)
有没有考虑一下探针的问题，有没有可能降解了，或者里面混有小片断，可以电泳看一下探针的完整性。
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10楼2008-05-09 15:57:13
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