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怎么利用PCR技术定向插入一段DNA序列？
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怎么利用PCR技术定向插入一段DNA序列？ |
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4楼2008-05-06 21:08:04
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可以在引物设计时引入限制酶位点。当DNA片段两端为非同源的粘性末端时，可实现定向克隆，这时的连接效率非常高，是重组方案中最有效、简捷的途径. 由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成3-4个碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5'端改变1个或几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的长度，而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆，此方法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5'加端法更为适宜。 T4DNA聚合回切产生粘端：如PCR两引物的5'末端是A或T，则可在其5'端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需在PCR引物的5'端加2-4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。 以上内容摘自genecool。下面的连接中讲了很多关于PCR和基因定向克隆。http://www.genecool.com/bbs/thread-8142-1-1.html 希望能给你帮助。 l |
3楼2008-05-05 18:24:43
