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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】菌落PCR扩增目的基因
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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humants

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】菌落PCR扩增目的基因

我要PCR扩增目的基因，可是含目的基因的质粒老是提不出来，我打算用菌落PCR来扩增目的基因，不知道可不可以？？？可信度高么？.
如果可以因该注意些什么问题？能否详细点本人是新手，谢谢

注：
我的宿主菌是DH5a；目的基因大小是1.0Kb
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1楼 2008-05-04 20:57:21
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张力民

铜虫 (小有名气)
质粒怎么会提不出来呢？
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2楼2008-05-04 21:42:01
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humants

金虫 (正式写手)
求助】质粒提不出来

我最近打算做PC扩增目的基因，引物都来了，却发现目的基因提不出来了，老板还催着，着急啊。

我的目的基因所用的载体是invitrogen的pcDNA3.1/ZEO(+)，其上面用的Ori是PUC origin ,我看文献上说这种复制子拷贝数能到100多，但是除了第一次转化完了，用保存完菌种剩下的提出来了一次，以后提了三次除了RNA什么都没有。

我问老师他说可能是抗生素失效了，于是我就用无抗性的DH5Α做了一次抗生素对照,结果什么都没长，抗生素没问题，我实在想不出别的原因了，还不好意思去问老师，还请各位虫友给以指点，不胜感激。

载体图谱：
（附件中也有）
http://tools.invitrogen.com/cont ... pcdna3.1zeo_map.pdf
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3楼2008-05-04 22:20:59
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yufangbo

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):欢迎常来，赠人玫瑰，手有余香。谢谢
humants(金币+2,VIP+0):谢谢...我试一下
菌体PCR是可以的，只要在反应体系中加入一定量的吐温20（10%，25微升体系加2微升），另外只要用白枪头在菌落上蘸一下即可转入PCR管中，菌落量不可过多，另外菌体最好是刚培养出来的，不要过老，祝你好运
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4楼2008-05-05 09:06:29
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zyjwl2004

木虫 (正式写手)
我现在也遇到这样的问题，不知道怎么办啊
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5楼2008-05-05 18:55:08
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山东大葱

铁虫 (初入文坛)
用你的菌液扩不就可以
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没有做不到只有想不到!
6楼2008-05-05 21:43:14
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phyllislhy

木虫 (正式写手)
你的目的基因在大肠杆菌中是否有同源基因？
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7楼2008-05-05 22:35:27
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yorkchen

★
humants(金币+1,VIP+0):谢谢，我做菌落PCR了，没出来，只能做转化了。
强烈怀疑你的提质粒的方法， 用的是 试剂盒的话，其实很好提（DH5a），注意看试剂盒的注意事项，比如菌的多少啊，加rnase之类的，

如果不行，建议你再次转化，注意平板的抗生素。


然后如何cology PCR的话，注意保真扩增，否则做定点突变烦死人，而且如何考虑宿主菌是否会有能被扩增的类似大小的条带。祝你好运！
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8楼2008-05-05 23:40:51
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humants

金虫 (正式写手)
大家好,我临时不用用菌落PCR,我的质粒提出来了,质粒PCR也已经出来了.谢谢大家的帮助.
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9楼2008-05-10 19:34:09
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taishuai2004

麻烦

★
humants(金币+1,VIP+0):谢谢..对我以后的实验很有帮助..呵呵
其实根本就不用提质粒 只有做酶切才需要
用菌液煮沸十分钟 再离心一下 取上层做模板就可以了
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10楼2008-05-10 20:49:14
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