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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】菌落PCR扩增目的基因
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jerome711

银虫 (小有名气)
楼上仁兄说的可行否，我要试试
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做懂得生活的人
11楼2008-05-10 22:27:41
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humants

金虫 (正式写手)
可以，步骤如下：
转录/翻译分析的菌落PCR
1．用200μl 的枪头或无菌牙签从平板上挑取菌落。选取直径大于1mm的菌落，获得尽可能多的
细胞。如果要保留菌落的拷贝，转移之前枪头轻触平板。
2．将细菌转移至装有50μl 无菌水的0.5ml 管中。振荡使细胞分散。
3．将管置于沸水或99℃加热5 分钟使细胞裂解、DNase变性。
4．12000g离心1分钟以去除细胞残片。
5．取10μl上清液加入0.5ml 空管中以备 PCR。用之前置于冰上。
6．菌落PCR 反应体系
31.75 μl 无菌水
1 μl dNTP 混和物 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
1 μl pET 上游引物, 5 pmol/μl
1 μl 下游引物, 5 pmol/μl
5 μl 10X NovaTaq™ 缓冲液 MgCl2,
0.25 μl (1.25 U) NovaTaq DNA 聚合酶
40 μl 总体积
考虑到吸取液体的损失，可乘以X .5 倍， X 代表反应次数。
注意：为了获得长而复杂目的片段的最大产量和专一性，可以分别选用KOD XL DNA 和KOD 热启动DNA 聚
合酶，配合相应的缓冲液和循环条件（参见TB320）。KOD聚合酶在日本没有供应。
7．每个样品中加入40μl PCR反应混和物，轻柔混和，加入两滴矿物油，将样品放入PCR 仪。
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12楼2008-05-13 20:29:40
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