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humants金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助】菌落PCR扩增目的基因
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我要PCR扩增目的基因，可是含目的基因的质粒老是提不出来，我打算用菌落PCR来扩增目的基因，不知道可不可以？？？可信度高么？. 如果可以因该注意些什么问题？能否详细点本人是新手，谢谢 注： 我的宿主菌是DH5a；目的基因大小是1.0Kb |
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humants
金虫 (正式写手)
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可以，步骤如下： 转录/翻译分析的菌落PCR 1．用200μl 的枪头或无菌牙签从平板上挑取菌落。选取直径大于1mm的菌落，获得尽可能多的 细胞。如果要保留菌落的拷贝，转移之前枪头轻触平板。 2．将细菌转移至装有50μl 无菌水的0.5ml 管中。振荡使细胞分散。 3．将管置于沸水或99℃加热5 分钟使细胞裂解、DNase变性。 4．12000g离心1分钟以去除细胞残片。 5．取10μl上清液加入0.5ml 空管中以备 PCR。用之前置于冰上。 6．菌落PCR 反应体系 31.75 μl 无菌水 1 μl dNTP 混和物 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1 μl pET 上游引物, 5 pmol/μl 1 μl 下游引物, 5 pmol/μl 5 μl 10X NovaTaq™ 缓冲液 MgCl2, 0.25 μl (1.25 U) NovaTaq DNA 聚合酶 40 μl 总体积 考虑到吸取液体的损失，可乘以X .5 倍， X 代表反应次数。 注意：为了获得长而复杂目的片段的最大产量和专一性，可以分别选用KOD XL DNA 和KOD 热启动DNA 聚 合酶，配合相应的缓冲液和循环条件（参见TB320）。KOD聚合酶在日本没有供应。 7．每个样品中加入40μl PCR反应混和物，轻柔混和，加入两滴矿物油，将样品放入PCR 仪。 |
12楼2008-05-13 20:29:40
2楼2008-05-04 21:42:01
humants
金虫 (正式写手)
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求助】质粒提不出来 我最近打算做PC扩增目的基因，引物都来了，却发现目的基因提不出来了，老板还催着，着急啊。 我的目的基因所用的载体是invitrogen的pcDNA3.1/ZEO(+)，其上面用的Ori是PUC origin ,我看文献上说这种复制子拷贝数能到100多，但是除了第一次转化完了，用保存完菌种剩下的提出来了一次，以后提了三次除了RNA什么都没有。 我问老师他说可能是抗生素失效了，于是我就用无抗性的DH5Α做了一次抗生素对照,结果什么都没长，抗生素没问题，我实在想不出别的原因了，还不好意思去问老师，还请各位虫友给以指点，不胜感激。 载体图谱： （附件中也有） http://tools.invitrogen.com/cont ... pcdna3.1zeo_map.pdf |
3楼2008-05-04 22:20:59
yufangbo
铁杆木虫 (著名写手)
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4楼2008-05-05 09:06:29