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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Gateway构建载体BP反应涂平板长不出单菌落
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okletsgo

新虫 (初入文坛)

[求助] Gateway构建载体BP反应涂平板长不出单菌落 已有5人参与

最近在用Gateway方法构建载体，目的片段再300-1000bp不等，要构建好几个载体，同时做BP反应后涂平板，有的能长出单菌落，有的长不出来，而且LR反应正常而且转化效率很高，长不出的那几个载体反复做了好几次，BP酶也换过新的了，抗生素浓度也减半了，还是涂平板长不出单菌落，求解！
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1楼 2014-10-22 10:22:55
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

将目的片段浓度是多少？如果太小需要加大，一般来说PCR产物和入门载体之间的比例是1：1，另外就是反应时25度下>=5h，注意要保证温度的稳定，最好就放在PCR槽里孵育。
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12楼2015-04-30 08:30:16
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-23 12:33:22
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够，我自己的体系是PCR产物1微升（大于80 ng/ul），载体1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混匀室温3 h转入TOP 10
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2014-10-22 14:20:19
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okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2014-10-22 14:20:19
1 是否使用了正确可抗性平板
2 加入BP反应的DNA浓度是否足够，我自己的体系是PCR产物1微升（大于80 ng/ul），载体1微升（大于100 ng/ul），BP 0.5微升，混匀室温3 h转入TOP 10

我是PCR产物150ng，载体50ng，BP 1微升，25℃过夜连接
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3楼2014-10-22 14:56:07
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大笨熊敏

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
okletsgo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 21:07:25
你看过Gateway构建载体的那篇说明书了没有的。它上面介绍说目的产物和载体大约都在150ng左右，我做BP反应一般只反应10h，时间太长好像也会有影响。
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4楼2014-10-22 20:47:06
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