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肿瘤干细胞培养遇到问题了，望众多虫友不吝赐教！ 已有2人参与
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养肿瘤干细胞的前辈们，lz培养大肠癌干细胞遇到一些问题，不知道你们以前遇到过吗？ 1、不加血清的培基分离肿瘤干细胞：由于干细胞只是很小一部分，种到培养瓶中的细胞大多数都要死亡，只有少数自我更新成球。原代培养肿瘤干细胞长得时间比较长，我的培养瓶中会出现黑色圆圆的东西，培基还是很清澈的，那些是细胞碎片吗？大家原代细胞状态是怎么样的？ 1.用不加血清的培基分离肿瘤干细胞后，3-5天成球，一周后我传代种板做细胞试验，但问题是传代后，培养瓶细胞长得很慢，死细胞也很多，是消化损伤到干细胞造成的吗？（我是这样传代的，先收集悬浮细胞，800r/min离心5min，弃上清，PBS重悬清洗，再离心弃上清，加0.05%TE消化30秒，终止消化，离心用不含血清的全培重悬，然后接种到培养瓶中和用于细胞试验。）你们是怎么传代的？ 2、细胞试验中，96孔板里面细胞只长48h，这样短的时间传代的细胞正常生长是什么状态呢？应该不能成球吧，我检测的不加药的细胞活性很低很低，真是伤心啊！是哪里出问题了呢？ |
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3楼2014-10-10 14:31:12
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
努力从容1s: 金币+6, ★★★很有帮助, 谢谢，非常详细！ 2014-10-13 15:15:41
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支原体污染Q&A 1、Q: 支原体污染对细胞有什么危害？ A: 支原体污染后，不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细 胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞收到多方面潜在影响，如引起细胞变形， 影响 DNA 合成，抑制细胞生长等，以致影响实验数据的可信度。 2、Q: 支原体污染有什么特征？ A: 细胞状态变差,生长变慢，在显微镜下观察可能会有小黑点，但培养基一般不发生 浑浊。细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细 胞漂浮，完全死亡。具体特征请见附件 2。 3、Q: 细胞培养时，显微镜下的小黑点是什么？ A: 支原体污染后，细胞凋亡坏死，释放出大量碎片，看起来就像小黑虫子。 4、Q: 细胞通过何种途径感染支原体？ A: 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是 正常菌群如口腔中的支原体）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材 的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染等等，由于支原体大小为 0.1~0.8 um，无细 胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um），血清中也可能含有支原体。 5、Q: 支原体污染如何检测？ A: 利用支原体具特殊专一性之 primers，经由 PCR 反应来复制支原体 DNA。所用 primers 来自支原体的 conserved 16S-23S rRNA 序列，由于此段序列依支原体种类不同而不同， 因此可依所复制之 DNA 大小及其 restriction fragment 大小差异来作侦测与鉴定支原体 （具体方法见附件）。 6、Q: 如何清除支原体？ A: 由于市场同类产品都为抗生素类，对细胞本身也会产生一定影响，而且有反复发 作的风险，吉锐生物推出的 MycoplasmaOUT™ Treatment，活性成分为抗菌肽，经多方测试表明对 大部分细胞无毒害作用，因其独特的作用原理，支原体不会对其产生耐药性，并且其作 用时间短，在三天内就可杀灭支原体，并自动降解成氨基酸，不会对细胞造成二次污染。 7、Q: 为什么在培养细胞前要加入MycoplasmaOUT™ Prevention？ A：由于支原体污染后能够进入细胞，而MycoplasmaOUT™ Prevention不能够进入细胞内也就不能杀灭已经进入细胞的支原体，而这部分细胞死亡时会释放其内部的支原体，需要MycoplasmaOUT™ Prevention来杀灭新释放出的支原体，以防止新生细胞受到污染。 8、Q: 所谓的黑胶虫污染？ A:培养细胞发现小黑点现象很严重，原来对“黑胶虫”一说嗤之以鼻，认为那不过是自欺欺人的借口，觉得怎么也不会发生在自己身上。但是真的就碰上了：细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。 上述现象很像所谓的“黑胶虫”。 我感觉实际是支原体感染以后细胞生长不好造成的碎片和感染原虫（现在看来是些胞外囊泡）的混合体。这种现象的直接原因是支原体等原虫感染，间接表象是小黑点，被以讹传讹成为了“黑胶虫”。 光镜下看不到支原体，但是可以看到支原体感染的终末现象——细胞凋亡坏死，释放出大量碎片，看起来就像小黑虫子。 查找类似的帖子——很多人是更换血清后出现这种问题； 说空气传播的可能是一个培养箱的人都用了同一种血清，而不是可以通过培养箱空气传播；感染最可能是牛源性的支原体，通过产道或血行感染。 所谓“细胞生长不受影响”，其实是污染的严重程度不高而已； 支原体污染严重就出现细胞大量空泡形成，细胞间空旷地带出现大量黑点，细胞最终凋亡、坏死，漂起来。有些国产血清写着建议灭活，其实是挂羊头卖狗肉，那个56度30分钟更多的是为了杀杀支原体的。实际上还有很多杀不死的。但可以降低产品支原体等微生物污染风险。用阿奇霉素杀支原体，小黑点可以得到抑制，不过我想根治就很难了，而且处理时间很长，至少一个星期。 以上是自己个人总结的一点看法。建议不要总拿子虚乌有的“黑胶虫”来说事。多考虑看不到的支原体，不要还停留在培根时代——只相信自己眼睛看见的。 |
2楼2014-10-10 14:28:54
4楼2014-10-13 15:21:02
5楼2014-10-13 15:22:07
